II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị tơm và quản lý thí nghiệm
2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản
3.3. Kết quả sàng lọc các dịng P.pastoris GS115 mang nhiều bản sao gen VP
GS115 mang nhiều bản sao gen VP28
Hai trăm khuẩn lạc mọc tốt, to, trịn, rời trên mơi trường MD (trong đĩ cĩ 100 khuẩn
lạc clone 7 và 100 khuẩn lạc clone 11) được chọn để kiểm tra kiểu hình bằng cách nuơi cấy lần lượt trên 3 mơi trường MM, MD và YPD ở 28°C trong 3 ngày. Kết quả nuơi cấy cho thấy 182 khuẩn lạc cĩ khả năng mọc tốt trên cả 3 mơi trường chọn lọc; các khuẩn lạc này sẽ được dùng cho quá trình chọn lọc tiếp theo.
Hình 6. Sự hiện diện của gene VP28 trong genome của 1 số chủng nấm men Giếng M: Thang DNA 100bp Giếng pPIC9K: plasmid pPIC9K. Giếng p-VP28: plasmid pPIC9K-VP28
85
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
Giếng P.P: Pichia pastoris
Giếng P.pPIC9K: P.pastoris –pPIC9K.
Giếng 120, 120A, 125, 126, 179: chủng số 120, 120A, 125, 126, 179
Sự hiện diện của gen VP28 trong 182 khuẩn lạc nấm men chọn lọc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F và AOX1-R dựa trên khuơn mẫu là DNA tổng số của tế bào nấm men. Kết quả cho thấy các chủng nghiên cứu đều cho 2 vạch: khoảng 1.117 bp (kích thước của gen VP28 thêm 492bp - kích thước từ vị trí bắt cặp của mồi trên hệ gen P.
pastoris đến vị trí gắn chèn) và khoảng 2,2 kb - kích thước của gen AOX1 (Hình 6). Như vậy, tất cả các chủng nấm men kiểm tra đều cĩ chứa pPICK9K-VP28 trong genome; nĩi cách khác, gen VP28 đã được biến nạp thành cơng vào bợ gen của nấm men P. pastoris với kiểu hình Mut+.
Sau khi tạo dịng thành cơng, quá trình sàng lọc dịng P.pastoris cĩ khả năng biểu hiện pro- tein VP28 cao nhất được thực hiện bằng cách cấy chuyển 182 khuẩn lạc sang mơi trường YDP
cĩ bổ sung G418 ở các nồng đợ 4mg/l và 6mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định được 123/182 khuẩn lạc cĩ khả năng kháng Geneticin 418 ở nồng đợ 4mg/l và 62 khuẩn lạc kháng G418 ở nồng đợ 6mg/l (Hình 7). Theo lý thuyết, 62 khuẩn lạc này cĩ chứa 14-18 copy gene VP28 trong genome và chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28.
Hình 7. Kết quả chọn lọc dịng P. pastoris mang tái tổ hợp pPIC9K-VP28 kháng 6ppm
Geneticin
3.4. Kết quả sàng lọc các dịng P.
pastoris GS115 cĩ khả năng tiết protein VP28 ngoại bào
Sáu mươi hai chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pPICK9K (đối chứng âm) được cảm ứng biểu hiện protein trên mơi trường nuơi cấy sinh khối BMGY và kích thích methanol 2% trên mơi trường BMMY trong 72 giờ. Sự hiện diện của protein VP28 trong dịch nuơi cấy được phân tích bằng kỹ thuật Western blot với kháng thể đặc hiệu của VP28. Kết quả biểu hiện protein đã xác định được 25 chủng cĩ sự hiện diện của protein VP28 trong dịch nuơi cấy. Tuy nhiên, chỉ 5 chủng: 120, 120A, 125, 126, 179 cho vạch rõ ràng ở kích thước khoảng 28 kDa trên bản gel chạy Western blot với kháng thể kháng VP28 được dùng để nghiên cứu tiếp theo.
Hình 8. Protein VP28 trong dịch nuơi cấy nấm men
M: Thang protein;
120, 120A, 125, 126, 179: các chủng nấm men Ctrl(-): Chứng âm-nấm men cĩ pPICK9K rỗng