II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị tơm và quản lý thí nghiệm
2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản
3.1. Tạo dịng vector tái tổ hợp pPIC9K VP28 trong tế bào E.coli JM
VP28 trong tế bào E.coli JM109
Kết quả nhân dịng gen mã hĩa protein VP28 được thể hiện trong Hình 1. Theo đĩ đoạn gen được khuyếch đại cĩ đợ dài khoảng 650 bp tương đương với đợ dài của đối chứng dương là chủng virus WSSV nhận được từ ĐH Arizone (Mỹ) và phù hợp với chiều dài lý thuyết của sản phẩm khuếch đại là 645 bp.
Sau xử lý với enzyme cắt giới hạn, băng DNA VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/EcoRI- NotI được phân tách trên gel agarose 1,2% và được cắt ra để tinh sạch nhằm loại bỏ những DNA tạp khơng mong muốn. Kết quả kiểm tra kích thước, đợ sạch của VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K /EcoRI-NotI được thể hiện ở Hình 2. Theo đĩ băng VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/ EcoRI-NotI cĩ kích thước tương ứng với lý thuyết là 645bp và 9276bp và khơng tạp nhiễm với DNA cĩ kích thước khác.
Vector tái tổ hợp PIC9K-VP28 được chuyển vào E. coli JM109 bằng kỹ thuật sốc nhiệt và vi khuẩn sau biến nạp được trải trên mơi trường thạch LB bổ sung ampicilin 50µg.10-1ml. Sáu khuẩn lạc được chọn để kiểm tra sự hiện diện của gen VP28 bằng phương pháp PCR với bợ mồi VP28YE-FW và VP28YE-R-His. Kết quả
83
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
phân tích (Hình 3) cho thấy cả 6 dịng vi khuẩn 6-11 đều cho kết quả dương tính với gen VP28. Trong đĩ hai khuẩn lạc 7 và 11 cho kết quả khuyếch đại tốt hơn nên được chọn cho phân tích tiếp theo với enzyme cắt giới hạn.
Hình 1. Kết quả khuyếch đại gen VP28 bằng phương pháp PCR
Giếng M: Thang DNA 100bp. Giếng Pos: chứng dương; Giếng Neg: chứng âm; W: chủng virus WSSV sử dụng làm khuơn mẫu.
Hình 2. VP28 và pPIC9K sau khi xử lý với enzyme EcoRI và Not I.
Giếng M1: thang DNA 1Kb. Giếng M2:
thang DNA 100bp
Hình 3. Kết quả phân tính dịng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28
Giếng 6-11: Khuẩn lạc E. coli sau biến nạp
với pPIC9KVP28
Giếng M: Thang DNA
Giếng Pos: Chứng dương với WSSV Giếng Neg: Chứng âm với vi khuẩn E.coli
Sự hiện diện của vector tái tổ hợp pPIC9K- VP28 trong hai khuẩn lạc 7 và 11 được kiểm tra bằng cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI
và NotI. Kết quả cho thấy vector tái tổ hợp
pPIC9K-VP28 của dịng vi khuẩn 7 và 11 sau khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn cho hai băng sản phẩm, băng cĩ kích thước nhỏ tương ứng với kích thước của gen VP28/EcoRI-NotI và băng cĩ kích thước lớn tương đương kích thước của pPIC9K/EcoRI-NotI (Hình 4); ngồi ra khơng cĩ vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng cắt đã được thực hiện hồn tồn.
Hình 4. Kết quả cắt pPIC9K-VP28 với EcoRI và NotI
Giếng M1, M2: thang DNA 1kb và 100bp Giếng 1, 2: Gen VP28/EcoRI-NotI; pPIC9K/EcoRI-NotI;
Giếng 3, 5, 4, 6: pPIC9K-VP28 của vi khuẩn 7 và 11 chưa và đã xử lý enzyme
84 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
Để kiểm tra đợ chính xác của trình tự gen VP28 và vị trí nối với vector pPIC9K, plasmid tái tổ hợp tách từ hai dịng 7 và 11 được chọn giải trình tự tại cơng ty Nam Khoa (Việt Nam). Kết quả cho thấy giải trình tự gen VP28 của 2 dịng giống nhau và tương đồng 100% với các chủng WSSV được phân lập từ nhiều quốc gia gồm Hàn quốc (JX515788.1), Trung Quốc
(AF332093.2), Nhật Bản (AY249443.1), Mỹ (AY249442.1), Indonesia (AY249441.1), Ấn Đợ (DQ681069.1), Việt Nam (AY168644) đã được cơng bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Ngồi ra, phân tích dịch mã cho thấy gen VP28 đặt trong vector pPIC9K-VP28 cho phép mã hĩa mợt protein tái tổ hợp cĩ 204 a.a và được gắn thêm 6 Histidine vào đầu C-terminal của protein này (Hình 5).
Hình 5. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid giả định protein VP28 được định mã từ
vector pPIC9K-VP28 của dịng vi khuẩn 7 và 11
Từ những kết quả trên, chúng tơi cĩ thể khẳng định đã tạo được hai dịng vi khuẩn E.coli JM109 mang vector pPIC9k chứa gen mã hĩa protein VP28 của virus WSSV. Trên vector pPIC9K, đoạn gen mã hĩa protein VP28 được gắn thêm mợt trình tự nucleotide mã hĩa 6xHis ở đầu 3’ đã được chèn vào vị trí ngay sau trình tự mã hĩa peptide α-factor.