II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị tơm và quản lý thí nghiệm
2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản
2.3.3. Chọn lọc dịng P.pastoris mang gen VP28 và cĩ khả năng biểu hiện protein
VP28 và cĩ khả năng biểu hiện protein
(1). Chọn lọc dựa trên tốc độ tăng trưởng trên mơi trường chứa methanol
Chuyển các chủng Pichia tái tổ hợp trên mơi trường Minimal dextrose (MD) sau điện biến nạp sang mơi trường Minimal methanol
(MM), MD và Yeast extract peptone dextrose (YPD), theo thứ tự. Ủ các đĩa mơi trường ở
28°C trong 2-3 ngày. Các chủng Mut+ và MutS
được phân biệt dựa vào mức đợ tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình thường trên cả MM và MD, trong khi, MutS chỉ tăng trưởng trên mơi trường MD mà khơng hoặc tăng trưởng yếu trên MM.
(2). Chọn lọc dịng nấm men mang gene mục tiêu bằng PCR
Sự hiện diện của plasmid pPIC9K-VP28 trong các dịng P. pastoris được xác định
bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F ( 5 ’ G A C T G G T T C C A AT T G A C A A G C )
và AOX1-R (3’GCAAA
82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
nấm men được tách chiết bằng bợ kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Điều kiện phản ứng: 10ng DNA; 1,25µl mồi (10µM), 0,5µl dNTP mix (10mM),
2,5µl dung dịch đệm và MgCl2 (10x), 1µl Taq
polymerase (1U), ddH2O cho đủ 25µl. Chế đợ nhiệt của phản ứng : 94°C trong 5 phút, sau đĩ là 30 chu kỳ 94°C trong 5 giây, 55°C trong 30 giây, 72°C trong 2 phút 30 giây và cuối cùng là chu kỳ 72°C trong 10 phút. Kết quả được điện di trên agarose gel 1%.
(3). Chọn dịng P. pastoris mang nhiều gen VP28 trên mơi trường YPD Geneticin
Vector pPICK9K cĩ trình tự mã hĩa cho gen kanamycine, gen này khơng kháng kháng sinh kanamycine mà kháng G418. Mức kháng G418 phụ thuợc vào số lượng gen kanamycine tích hợp trong P. pastoris. Giữa gen kanamycine và “cassette biểu hiện” cĩ mợt mối liên hệ di truyền, dựa vào đĩ người ta cĩ thể suy luận rằng những dịng cĩ khả năng kháng G418 ở nồng đợ cao thường chứa nhiều bản sao của gen được biến nạp vào và do đĩ khả năng biểu hiện protein cao hơn. Do đĩ, các dịng P. pastoris pPIC9K- VP28 đã chọn lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được chuyển sang mơi trường YPD cĩ G418
nồng đợ 2, 4, 6mg/ml. Chọn dịng P. pastoris
pPIC9K-VP28 cĩ khả năng kháng G418 ở nồng đợ cao nhất.