II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu vật sinh học
TƠM CÀNG XANH (MACROBRACHIUM ROSENBERGII)
Nguyễn Thảo Sương1 TĨM TẮT
Nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của catecholamine stress hormone Norepinephrine và Dopamine lên đợc lực của 4 chủng vi khuẩn bao gồm Vibrio harveyi BB120, Vibrio campbellii
LMG21363, Vibrio anguillarum HI610 và Vibrio anguillarum NB10 gây bệnh trên ấu trùng tơm càng xanh. Nghiên cứu in vitro cho thấy, Norepinephrine và Dopamine ở nồng đợ 100 µM khơng làm gia tăng đợc lực bao gồm khả năng dung huyết, khả năng sinh các enzyme ngoại bào caseinase, chitinase của các chủng Vibrio được khảo sát. Tuy nhiên, việc bổ sung catecholamines làm tăng mạnh khả năng di đợng của tất cả các chủng Vibrio trên mơi trường thạch mềm Luria- Bertani (LB) cĩ chứa 0,3% agar. Trong thí nghiệm in vivo, vi khuẩn V. harveyi được tăng sinh với catecholamines stress hormone trong 24 giờ, sau đĩ được rửa sạch trước khi đem cảm nhiễm với ấu trùng tơm càng xanh nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của catecholamines lên ấu trùng. Kết quả cho thấy, việc nuơi cấy V. harveyi với Dopamine khơng làm gia tăng tỉ lệ chết của ấu trùng tơm càng xanh khi so sánh với lơ đối chứng. Ngược lại, vi khuẩn V. harveyi được nuơi cấy với Norepinephrine 100 μM làm gia tăng đợt ngợt tỉ lệ chết của ấu trùng. Đây là báo cáo đầu tiên về ảnh hưởng của stress hormone lên vi khuẩn Vibrio gây nhiễm trên đối tượng tơm càng xanh M. rosenbergii.
Từ khĩa: Macrobrachium rosenbergii, stress hormones, Vibrio.
1 Phịng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản 2. Email: thaosuong_86@yahoo.com.vn Email: thaosuong_86@yahoo.com.vn
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình trạng stress của sinh vật chủ từ lâu đã được biết đến như mợt nhân tố gây ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tương tác giữa vật chủ-vi khuẩn thơng qua việc làm suy giảm hệ thống miễn dịch. Gần đây, nhiều bằng chứng cho thấy, ở vi khuẩn gây bệnh đường ruợt tồn tại mợt hệ thống đặc hiệu nhằm phát hiện các hormone được tiết ra khi sinh vật chủ bị stress và việc phát hiện các hormone này làm vi khuẩn gia tăng đợc lực (Lyte, 2004). Nhiều thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng, stress hormone làm thay đổi khả năng di đợng, gia tăng mật đợ vi khuẩn, đẩy nhanh quá trình hình thành màng sinh học (biofilm) và (hoặc) làm gia tăng đợc lực của vi khuẩn gây bệnh (Verbrugghe, 2012).
Vì vậy trực tiếp ảnh hưởng lên quá trình gây bệnh của vi khuẩn lên sinh vật chủ. Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới về stress hormone cịn khá khiêm tốn về mặt số lượng và đa phần được thực hiện với nhĩm vi khuẩn đường ruợt
Escherichia coli.
Vi khuẩn Vibrio là nhĩm vi sinh vật gây bệnh quan trọng ở đợng vật thủy sản, đặc biệt là cá và giáp xác sống ở đợ mặn cao (Barbieri và ctv., 1999). Mặt khác, catecholamine stress hormones được tìm thấy ở cả cả giáp xác và đợng vật khơng xương sống (Ottaviani và Franceschi, 1995). Bước đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnh Vibrio, stress hormone và sinh vật chủ như tơm càng xanh là căn cứ sâu hơn để hồn thiện việc xác định cơ chế gây bệnh, nhằm đề ra các biện pháp phịng trị bệnh hiệu quả.
123
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Thí nghiệm in vitro
2.1.1. Chuẩn bị chủng vi khuẩn
Bốn chủng vi khuẩn Vibrio được cung cấp từ phịng thí nghiệm Artemia Reference Center, đại học Gent, Bỉ. Các chủng vi khuẩn gây bệnh đều được tăng sinh trong mơi trường LB Broth bổ sung với 12g/l NaCl trong 24h, sau đĩ được pha lỗng cho đến khi OD600 đạt giá trị khoảng 0,5. Trong tất cả các thí nghiệm, 10 μl dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẽ được nhỏ vào trung tâm của đĩa thạch.
2.1.2. Thí nghiệm khảo sát khả năng di động
Ảnh hưởng của catecholamine stress hormone lên sự di đợng của vi khuẩn được kiểm tra bằng cách sử dụng đĩa thạch mềm LB (0,3% agar) bổ sung Dopamine và Norepinephrine ở nồng đợ 100 μM. Mơi trường thạch khơng bổ sung 2 loại stress hormone trên đĩng vai trị đối chứng. Dịch vi khuẩn được nhỏ lên trung tâm của đĩa (10 μl), sau đĩ đem ủ trong tủ ấm ở 280C. Đường kính vùng di đợng của vi khuẩn được đo lần lượt sau 16h và 24h.
2.1.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng dung huyết, thủy phân casein và thủy phân chitin
Mơi trường thạch máu LB (5% máu cừu), mơi trường LB chứa 4% skim milk và mơi trường LB chứa 0,1% chitin bổ sung với Dopamine và Norepinephrine ở nồng đợ 100 μM được sử dụng lần lượt nhằm kiểm tra ảnh hưởng của catecholamines stress hormone lên khả năng dung huyết, thủy phân casein và thủy phân chitin của 4 chủng Vibrio. Tỉ số giữa đường kính vịng trong suốt xung quanh khuẩn lạc và đường kính của khuẩn lạc sau 48h được dùng để xác định ảnh hưởng của stress hormone lên các yếu tố đợc lực này.
2.2. Thí nghiệm in vivo
Hai mươi bốn giờ sau khi nở, ấu trùng tơm càng xanh được chuyển vào nuơi trong ống nghiệm cĩ chứa 100 ml nước biển (đợ mặn
12ppt, khử trùng ở 1210C, 20 phút) với mật đợ 30 ấu trùng/ống. Các ống nghiệm thủy tinh được đặt trong bể hình chữ nhật cĩ chứa nước cất với nhiệt đợ duy trì ở 28 ± 1 º C. Ấu trùng được cho ăn hai lần mỗi ngày với Artemia (giai đoạn instar II) ở mật đợ 5 Artemia/ ml/ngày. Khơng tiến hành thay nước trong suốt q trình thí nghiệm.
Vi khuẩn V. harveyi được tăng sinh 24h
trong mơi trường LB cĩ bổ sung stress hormone. Sau đĩ, stress hormone được loại bỏ nhằm tránh ảnh hưởng tới ấu trùng thí nghiệm bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn ở tốc đợ 5000 rpm trong 5 phút và hút bỏ dịch nổi. Phần sinh khối cịn lại của vi khuẩn được bổ sung mơi trường LB mới. Ấu trùng tơm càng xanh được cảm nhiễm với V. harveyi ở nồng đợ 106 CFU/ml bằng cách bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào mơi trường nước nuơi. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần.
Chỉ số phát triển giai đoạn của ấu trùng (LSI) được xác định dựa trên phương pháp của Maddox và Manzi (1976) bằng cách thu mẫu ngẫu nhiên 30 ấu trùng từ mỗi nghiệm thức tại ngày kết thúc thí nghiệm. LSI sau đĩ được tính bằng cơng thức:
LSI = Σ Si/N với Si là giai đoạn phát triển của mỗi ấu trùng tơm càng xanh tại thời điểm thu mẫu ( i = 1 tới 12); N là số ấu trùng.
Tỉ lệ sống của ấu trùng (%) = Số ấu trùng cịn sống tại ngày kết thúc thí nghiệm / số ấu trùng ban đầu. Ngày kết thúc thí nghiệm được xác định là ngày khi tỉ lệ chết ở lơ cảm nhiễm với vi khuẩn khơng bổ sung thêm stress hormone đạt 50%.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu sau khi thu thập được sẽ được xử lý bằng one-way ANOVA (phần mềm SPSS 21.0). Mức khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê được đề nghị là p < 0,05.