II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu vật sinh học
TỐI ƯU HĨA CÁC ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VACCINE BẤT HOẠT PHỊNG BỆNH GAN THẬN MỦ CHO CÁ TRA
PHỊNG BỆNH GAN THẬN MỦ CHO CÁ TRA
Lê Hồng Phước1, Võ Hồng Phượng1, Nguyễn Thị Hiền1, Ngơ Thị Bích Phượng1, Nguyễn Phạm Hồng Huy1, Chung Minh Lợi1 TĨM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tối ưu hĩa các điều kiện sản xuất vaccine sốc nhiệt bất hoạt phịng bệnh gan thận mủ trên cá tra. Chủng vi khuẩn dùng làm vaccine được phân lập và chọn lọc từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ thu tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và An Giang. Với phương pháp sốc nhiệt và kiểm tra protein sốc nhiệt bằng phản ứng SDS-PAGE và Western Blot cho thấy ở điều kiện gây sốc 41oC trong 30 phút E.
ictaluri sinh lượng heat shock nhiều hơn so với các điều kiện thử nghiệm khác. Thử nghiệm bốn loại mơi
trường canh dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB) và Hottinger cho thấy E. ictaluri phát triển tốt ở mơi trường BHIB. pH thích hợp cho chủng vi khuẩn này phát triển và duy trì đợc lực là 7,0. Khảo sát các điều kiện phát triển trong nồi lên men cho thấy ở điều kiện tốc đợ khuấy 200 vịng /phút, lượng khí thổi vào 6 lít/phút và thời gian thu hoạch vi khuẩn sau 36 giờ tăng sinh cho hiệu quả kích thích sinh miễn dịch tốt nhất. Vaccine sản xuất khơng cĩ tính đợc đối với cá tra, liều vaccine 3 x 109 CFU/cá cĩ khả năng kích thích sinh miễn dịch và bảo hợ cho cá với chỉ số RPS = 53%. Cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về tỷ lệ chết sau khi gây nhiễm ở nhĩm cá đối chứng và nhĩm được tiêm vaccine (p < 0,05). Từ khĩa: Cá tra, vaccine, Edwarsiella ictaluri
1 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản 2. Thủy sản 2.
Email: lehongphuoc@yahoo.com
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, cá tra được xem là đối tượng nuơi chủ lực của cả nước và tập trung chủ yếu ở khu vực Đồng bằng sơng Cửu Long. Hiện nay mợt số tỉnh đã và đang cĩ diện tích và sản lượng cá tra lớn nhất cả nước như: Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang.
Theo thống kê của Tổng Cục Thủy Sản, tình hình nuơi cá tra vẫn gặp nhiều khĩ khăn về giá và thị trường tiêu thụ trong các tháng đầu năm 2013. Ngồi ra, dịch bệnh trên cá tra hầu như khơng thể tránh khỏi và làm ảnh hưởng phần nào đến sản lượng thu hoạch. Bệnh gan thận mủ được xem là những bệnh thường xuất hiện và nguy hiểm nhất trên cá tra. Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn nuơi và thường nặng nhất ở thời điểm giao mùa hoặc khi mưa
nhiều làm nhiệt đợ nước giảm thấp dưới 28oC. Người nuơi đã can thiệp bằng nhiều biện pháp khác nhau trong đĩ đáng kể nhất là việc sử dụng kháng sinh. Kháng sinh cĩ thể phịng trị bệnh nhiễm khuẩn nhưng sẽ gây ra nhiều hậu quả đáng kể về việc kháng thuốc hoặc là dư lượng kháng sinh trong thịt cá. Trên thế giới, việc phịng bệnh bằng vaccine đã được áp dụng nhiều và mang lại hiệu quả trên cá hồi. Ngồi ra cũng đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vaccine trên các lồi cá khác như rơ phi, cá chép. Các loại vaccine được thử nghiệm bao gồm vaccine vơ hoạt, vaccine nhược đợc và vaccine tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này vaccine bất hoạt được sản xuất theo hướng sốc nhiệt nhằm mục đích mong muốn làm tăng hiệu quả của vaccine. Qua nghiên cứu cho thấy protein sốc nhiệt (heat shock
112 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
protein: HSP) làm tăng cường đáp ứng miễn dịch trên đối tượng thủy sản. Cụ thể là ấu trùng Artemia nuơi ở 28°C khi được gây sốc ở 37°C trong 30 phút và 6h hồi phục cho thấy khả năng đề kháng với vi khuẩn gây bệnh
Vibrio campbellii. Tỷ lệ sống tăng gấp đơi
ở nhĩm được gây sốc nhiệt so với nhĩm đối chứng chứng tỏ rằng HSP70 cĩ vai trị bảo vệ
Artemia đối với tác nhân gây bệnh (Yeong và
ctv, 2007, 2008). Hsp60 và Hsp70 được chiết xuất từ Escherichia coli cĩ khả năng kích
thích tăng hàm lượng kháng thể trên cá hồi sau khi được tiêm Hsp70. Vì vậy Hsp cĩ thể được xem như là chất làm tăng cường hiệu quả của vaccine (Plant và ctv, 2009).
Ở Việt Nam cho đến thời điểm này chỉ cĩ cơng ty TNHH PHARMAQ đăng ký sản phẩm vaccine trên cá tra nhưng chỉ ở bước đầu. Ngồi ra cĩ vài nghiên cứu về vaccine phịng bệnh gan thận mủ trên cá tra dưới dạng các đề tài nghiên cứu được thực hiện bởi các Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản hay các trường Đại Học. Trong nghiên cứu này quy trình sản xuất vaccine được tối ưu hĩa về mơi trường tăng sinh vi khuẩn, lượng khí thổi vào, tốc đợ khuấy cũng như thời gian thu hoạch vi khuẩn thích hợp.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu: Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Gly 09M) phân lập từ cá tra bệnh thu
ở ĐBSCL được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tạo vaccine, cá tra (20-25g/con khỏe mạnh, khơng bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri)
Thiết bị: Nồi lên men (10 lít), máy trợn
mẫu, máy quang phổ đo OD, máy ly tâm, tủ ấm, tủ cấy vi sinh, tủ mát 40C, tủ lạnh -20oC, -70oC, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự đợng, ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, bể kính (80 lít), …
Hĩa chất và mơi trường:
- Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn: Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth
(NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Hottinger và mơi trường thạch máu Blood Agar (BA) với 5% máu cừu.
- Dung dịch formaline bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê và mợt số hĩa chất thơng dụng khác gồm: nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine, …
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuơi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Dùng các mơi trường: Blood agar, Brain- Heart Infusion Agar cho phân lập vi khuẩn. Sử dụng test kit API 20E để test sinh hĩa và định danh vi khuẩn theo khĩa phân loại Bergey (1996). Ngồi ra cịn xác định E. ictaluri bằng phương pháp PCR
2.2.2. Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm
Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml EGME trong 5 lít nước) trong 3-5 phút. Sử dụng kim tiêm bán tự đợng (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho cá 10-40 g để đảm bảo an tồn cho cá thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực của vaccine
Đánh giá hiệu lực vaccine qua giá trị RPS - relative percent survival (tỷ lệ sống tương đối) theo cơng thức của Amend (1981):
Tỷ lệ % số cá vaccine chết
RPS (%) = (1- -------------------------------) x 100
Tỷ lệ % số cá đối chứng chết
2.3. Bố trí thí nghiệm:
Kiểm tra mơi trường thích hợp cho E. Ictaluri
Thí nghiệm 1: Theo dõi sự phát triển của vi
khuẩn trên 04 loại mơi trường
Sau 36-40h nuơi cấy E. ictaluri trên thạch máu tiến hành thu khuẩn lạc và tạo dịch huyền phù trong nước muối sinh lý. Đo mật đợ quang (OD550) và tính tốn mật đợ vi khuẩn ban đầu để
113
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
cho vào các 4 loại mơi trường thử nghiệm (NB, BHIB, TSB và Hottinger). Mật đợ vi khuẩn ban
đầu trong thí nghiệm này là 103 CFU/ml được
ủ ở 28oC và trong điều kiện nuơi cấy đợng (tủ ấm lắc, 150 vịng/phút). Sau mỗi 3h thu mẫu đo mật đợ quang và cấy trên mơi trường NA để xác định tổng số vi khuẩn.
Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của E.
ictaluri trong mơi trường BHIB và NB
Thí nghiệm được bố trí tương tự như thí nghiệm 1. Tuy nhiên chỉ cĩ 2 loại mơi trường được sử dụng là BHIB và NB với mục đích kiểm chứng mơi trường nuơi cấy nào thích hợp hơn
Thí nghiệm 3: Khảo sát sự phát triển của vi
khuẩn ở 6 giá trị pH là 4, 5, 6, 7, 8 và 9
Sử dụng mơi trường nuơi cấy BHIB, thể tích nuơi cấy 50 ml, điều kiện nuơi cấy lắc 150 vịng/phút, nhiệt đợ 28-30°C. Mật đợ vi khuẩn
E. icttaluri lúc bắt đầu nuơi cấy là 106 CFU/ml. Theo dõi mật đợ vi khuẩn bằng cách đo OD ở bước sĩng 550nm trong vịng 48 giờ (lấy mẫu 6 giờ/lần).
Thí nghiệm 4: Khảo sát sự phát triển của
vi khuẩn ở 5 giá trị pH gồm pH = 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0.
Sử dụng mơi trường nuơi cấy là BHIB, thể tích nuơi cấy 50 ml, điều kiện nuơi cấy lắc 150 vịng/phút, nhiệt đợ 28-30°C. Mật đợ vi khuẩn
E. ictaluri lúc bắt đầu nuơi cấy là 106 CFU/ml. Theo dõi mật đợ vi khuẩn bằng cách đo OD ở bước sĩng 550nm trong vịng 48 giờ (lấy mẫu 6 giờ/lần).
Thí nghiệm 5: Khảo sát sự phát triển của E.
ictaluri trên mơi trường BHIB ở pH = 6, 7 và 8
Ở thí nghiệm này cịn cĩ phần kiểm tra đợc lực của vi khuẩn sau khi được tăng sinh ở các điểm pH khảo sát. Vì vậy tại thời điểm 18 giờ sau khi tăng sinh tiến hành thu sinh khối vi khuẩn phát triển trong mơi trường BHIB ở 3 giá trị pH là 6, 7 và 8, pha lỗng để được nồng đợ gây nhiễm đồng nhất là 5 x104 CFU/cá. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm, mỗi pH mơi trường được tiêm cho 10 cá, lặp lại 3 lần, nghiệm thức đối
chứng tiêm với nước muối sinh lý cũng gồm 10 cá và lặp lại 3 lần. Theo dõi cá và ghi nhận số cá chết trong 2 tuần sau khi tiêm vi khuẩn.
Thí nghiệm 6: Bước đầu khảo sát 3 tốc đợ
khuấy đảo là 150, 200 và 250 vịng/phút trong nồi lên men LiFlus GX (Tăngil, Ấn Đợ).
Nhiệt đợ nuơi cấy trong nồi lên men được ổn định ở 28°C. Lưu lượng khí thổi vào của cả 3 lần khảo sát tốc đợ khuấy đảo là 2 L/phút. Mật đợ vi khuẩn E. ictaluri ban đầu là 103 CFU/ml trong thể tích nuơi cấy 5 L mơi trường BHI (pH = 7). Thu mẫu 3 giờ mợt lần trong vịng 48 giờ để đo OD550nm và trải đĩa xác định mật đợ tương đối của vi khuẩn.
Thí nghiệm 7: Căn cứ trên kết quả của thí
nghiệm trên xác định tốc đợ khuấy thích hợp (200 vịng/phút) sau đĩ tiến hành bố trí thí nghiệm ở các mức lượng khí thổi vào 2, 4, 6 và 8 lít/phút. Thu mẫu kiểm tra OD và cấy trãi đĩa xác định mật đợ vi khuẩn sau 3, 6,…48 giờ nuơi cấy trong nồi lên men
Thí nghiệm 8: Kiểm tra tính sinh miễn dịch
Nhân sinh khối E.ictaluri (GlyM09) trong điều kiện pH 7.0 nhiệt đợ 280C và tốc đợ khuấy 150 vịng/ phút, 200 vịng/phút đồng thời lượng khí thổi vào là 6 và 8 lít/phút cho mỗi tốc đợ khuấy. Tiến hành thu vi khuẩn tại các thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ sau đĩ tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn ở nhiệt đợ 410C trong 30 phút (điều kiện này đã được tối ưu), bất hoạt vi khuẩn bằng formalin 0,4% trước khi thử nghiệm vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản xuất vaccine tốt nhất thơng qua tỷ lệ bảo hợ của các nghiệm thức này.
Sau khi kiểm tra tính vơ trùng và an tồn của vaccine, tiêm vaccine cho cá tra thí nghiệm (20-25g/con) theo quy trình tiêm vaccine 2 lần mỗi lần với liều sử dụng 3x109 CFU/cá cách nhau 14 ngày, sau thời gian 2 tuần từ lúc tiêm vaccine lần 2 tiến hành cơng vi khuẩn mật đợ 1,5x104CFU/cá. Mỗi nghiệm thức gồm 90 cá (30 cá/bể x 3 bể).