II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu vật sinh học
116 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG 3 THÁNG 6/20143.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ
khuấy lên sự phát triển của E. ictaluri trong nồi lên men
Thí nghiệm 6: Kết quả ở đồ thị 7 cho thấy
giá trị OD550nm cao nhất khi vi khuẩn E. ictaluri được nuơi với tốc đợ khuấy đảo 250 vịng/phút, tiếp theo là 200 vịng/phút và thấp nhất ở 150 vịng/phút từ giờ thứ 21 đến giờ thứ 36.
Mặc dù kết quả đo OD550nm cho thấy cĩ sự khác biệt về sự phát triển của vi khuẩn E. ictaluri
ở các tốc đợ khuấy đảo khác nhau nhưng kết quả xác định mật đợ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp pha lỗng và trải đĩa lại cho thấy khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về mật đợ vi khuẩn giữa các tốc đợ khuấy (đồ thị 8).
Đồ thị 7. Ảnh hưởng của tốc đợ khuấy lên sự phát triển của E. ictaluri trong nồi lên men
thơng qua giá trị OD550nm
Đồ thị 8. Ảnh hưởng của tốc đợ khuấy lên sự phát triển của E. ictaluri trong nồi lên men thơng qua mật đợ tế bào vi khuẩn (CFU/ml)
Đồ thị 9. Giá trị OD của E. ictaluri khi nuơi cấy trong nồi lên men với tốc đợ khuấy 200
vịng/phút ở các mức lượng khí thổi vào khác nhau
Đồ thị 10. Mật đợ vi khuẩn trên mơi trường BHIA ở các thời điểm thu mẫu trong nồi lên men với tốc đợ khuấy 200 vịng/phút và lượng
117
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
3.5. Ảnh hưởng của lượng khí thổi vào
lên sự phát triển của E. ictaluri
Thí nghiệm 7: Kết quả khảo sát tốc đợ
khuấy 200 vịng/phút với các lượng khí thổi vào lần lượt là 2, 4, 6 và 8 lít/phút ở nồi lên men cho thấy ở nghiệm thức với lượng khí thổi vào là 6 lít/phút vi khuẩn phát triển đến mức cực đại sau 36h nuơi cấy trong nồi lên men (đồ thị 9). Tuy nhiên, sau đĩ mật đợ vi khuẩn giảm dần. So với các nghiệm thức khác thì ở nghiệm thức với lượng khí thổi vào là 8 lít/phút cho thấy vi khuẩn tăng nhanh mật đợ sau 30h nuơi cấy, sau đĩ cĩ sự biến đợng tăng giảm nhưng vẫn duy trì ở mức mật đợ cao cho đến 48h nuơi cấy trong nồi lên men. Nghiệm thức cĩ lượng khí thổi vào 2 lít/phút cho thấy cĩ giá trị OD thấp nhất so với các nghiệm thực khác ở hầu hết các điểm thu mẫu.
Kết quả thu mẫu cấy trải đĩa trên mơi trường BHIA cho thấy mật đợ vi khuẩn cao nhất ở nghiệm thức cĩ tốc đợ khuấy là 200 vịng/phút và lượng khí thổi vào là 6 lít/phút (đồ thị 10). Tiếp theo đĩ là 200 vịng/phút và lượng khí thổi vào là 8 lít/phút. Cũng giống như kết quả đo OD, mật đợ vi khuẩn ở lượng khí thổi vào 2 lít/phút là thấp nhất. Điều này cho thấy đối với vi khuẩn hiếu khí thì oxy rất cần thiết cho sự phát triển.
3.6. Sản xuất vaccine bất hoạt thơng qua sốc nhiệt protein trong vaccine sốc nhiệt protein trong vaccine
Thí nghiệm này được thử nghiệm 2 tốc đợ khuấy (150 và 200 vịng/phút) và 2 lượng khí thổi vào (6 và 8 lít/phút) và tiến hành thu vi khuẩn tại các thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ sau đĩ tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn ở nhiệt đợ 410C trong 30 phút (điều kiện tối ưu sốc nhiệt như đã trình bày ở phần trên) sau đĩ bất hoạt vi khuẩn bằng formalin 0,4% trước khi thử nghiệm vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản xuất vaccine tốt nhất thơng qua tỷ lệ bảo hợ của các nghiệm thức này. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm này chúng tơi cũng thu mẫu kiểm tra OD và mật đợ vi khuẩn cho từng nghiệm thức. Kết quả giá trị OD và số lượng tế bào/ml ở các nghiệm thức (đồ thị 11 và 12) cho thấy ở tốc đợ khuấy 200 vịng/phút và 150 vịng/phút với lượng khí thổi vào 8 lít/phút vi khuẩn phát triển tốt hơn so với nghiệm thức cĩ tốc đợ khuấy như trên nhưng lượng khí thổi vào 6 lít/phút. Bên cạnh đĩ, số lượng tế bào bắt đầu phát triển mạnh trong thời gian 33-36 giờ và bắt đầu giảm dần đến thời điểm 39 giờ. Trong khoảng thời gian 33-39 giờ thu sinh khối vi khuẩn và sốc nhiệt kiểm tra khả năng bảo hợ của vaccine ở 3 thời điểm 33, 36, 39 giờ với điều kiện trục khuấy 150, 200 vịng/phút và lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút. Ở phần sản xuất vaccine cho thí nghiệm này vi khuẩn được sốc nhiệt ở 41oC trong thời gian 30 (dựa trên kết quả các nợi dung khác thuợc phạm vi nghiên cứu của đề tài này)
Đồ thị 11. Giá trị OD của E. ictaluri khi nuơi cấy trong nồi lên men với tốc đợ khuấy 150 và 200 vịng/
phút ở các mức lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút
Đồ thị 12. Mật đợ E. ictaluri khi nuơi cấy trong nồi lên men với tốc đợ khuấy 150 và 200 vịng/phút ở
118 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
Kết quả tỷ lệ chết được trình bày ở đồ thị 13 cho thấy tỷ lệ chết các nghiệm thức với trục khuấy 200 vịng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/ phút tại thời điểm thu mẫu 36, 39 giờ và trục khuấy 200 vịng/phút, lượng khí thổi vào 8 tại thời điểm thu mẫu 39 giờ cĩ tỷ lệ chết dưới 50% và khác biệt đáng kể với các nghiệm thức cịn lại (p<0,05). Ngồi ra, tỷ lệ RPS (%) cho thấy tỷ lệ bảo hợ của vaccine ở nghiệm thức 200-6-36H (200 vịng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/phút, thu mẫu ở thời gian 36 giờ) là 53%, trong khi đĩ các nghiệm thức 200-6-39H, 200-8-39H lần lượt là 49,4% và 48,2%. Các nghiệm thức cịn lại dao đợng 23%-33%. Điều này cĩ thể khẳng định pH mơi trường cho q trình lên men, tốc đợ khuấy, lượng khí thổi vào và thời gian thu hoạch vi khuẩn cĩ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của vacvine.
Đồ thị 13. Tỷ lệ chết cợng dồn cá thí nghiệm sau khi được tiêm các nghiệm thức vaccine
khác nhau và gây nhiễm với E. ictaluri
IV. THẢO LUẬN
Sự khác biệt về tốc đợ phát triển của vi khuẩn trên các loại mơi trường khác nhau. Điều này cũng được ghi nhận ở các nghiên cứu khác khi sử dụng các loại mơi trường khác nhau. Khi cấy Escherichia coli O157:H7 và Staphylococcus aureus trong mơi trường Brain
Heart Infusion (BHI) với nhiều nồng đợ muối khác nhau Hajmeer và ctv (2006) tìm thấy nhiều tế bào bị tổn thương ở nồng đợ muối 5-10%.
Theo Jiang và Chai (1996), sự khác biệt về tổng số vi khuẩn đếm được trên mơi trường chọn lọc và khơng chọn lọc phản ánh số lượng tế bào bị tổn thương do yếu tố vật lý hoặc hĩa học. Lee và ctv (2006) mơ tả ảnh hưởng của đợ mặn và pH lên khả năng mọc của V. parahaemo-
lyticus trên mơi trường TCBS. Nhĩm tác giả này đi đến kết luận rằng PBS-3% NaCl (pH 6.6) thích hợp nhất cho V. parahaemolyticus phát
triển. Sự khác biệt về mơi trường cĩ thể dẫn đến vận tốc phát triển khác nhau. So sánh 4 loại mơi trường nuơi cấy V. vulnificus (1) cellobiose- colistin (CC) agar, (2) Vibrio vulnificus medium (VVM), (3) a modification of VVM agar (VVMc agar), và mơi trường TCBS, Cerdà-Cuéllar và ctv (2001) tìm thấy VVMc agar là mơi trường tốt nhất cho V. vulnificus. Kết quả
ở đồ thị 4.3 cho thấy ở mơi
trường BHIB E. ictaluri
phát triển mạnh hơn so với các mơi trường cịn lại. Đặc biệt đối với mơi trường Hottinger giá trị OD ở các thời điểm thu mẫu rất thấp và hầu như vi khuẩn khơng phát triển trong suốt thời gian thí nghiệm. Cĩ thể là đối với mơi trường này và với lượng vi khuẩn cấy vào ban đầu ít làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của khẩu phần dinh dưỡng đến tăng trưởng, thành phần các chất trong cơ thể, các chỉ tiêu huyết học và đặc biệt là khả năng đề kháng với Edwardsiella ictaluri của cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus, Lim và ctv (2009) cũng đã dùng mơi trường BHIB để tăng sinh vi khuẩn cho thí nghiệm gây cảm nhiễm. TSB được nhĩm tác giả Crumlish và ctv (2002) sử dụng làm mơi trường tăng sinh E. ictaluri
119
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
trong nghiên cứu phân lập định danh tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra thu tại ĐBSCL. Các nghiên cứu trong nước cho thấy BHIB đã được mợt số tác giả dùng để tăng sinh E. ictaluri như Phạm Cơng Thành (2010), Nguyễn Quốc Bình và ctv (2010), Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2009). Tuy nhiên các tác giả này khơng cĩ nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của E.
ictaluri trên các loại mơi trường mà chúng tơi sử
dụng trong thí nghiệm này.
Theo Natha và ctv (2009) khi nghiên cứu sự phát triển của E. ictaluri cho thấy lồi vi
khuẩn này khơng cĩ khả năng phát triển trên mơi trường BHIB ở pH thấp. Tuy nhiên, khi cĩ bổ sung thêm nguồn urea thì vi khuẩn này cĩ khả năng phát triển ở pH = 5. Shotts và Waltman (1990) khi nghiên cứu phát triển của E. ictaluri trên mơi trường Edwardsiella ictaluri agar cũng chọn pH = 7-7,2. Các dẫn liệu này cho thấy kết quả của thí nghiệm này khá tương thích với các kết quả trước đây nghiên cứu pH lên sự phát triển của E. ictaluri. Theo Collins và Thune
(1996) khi khảo sát sự phát triển của E. ictaluri trên mơi trường pha chế cĩ bổ sung nhiều thành phần bao gồm khống, vitamine, acid amine,... với các giá trị pH khác nhau cho thấy mật đợ vi khuẩn cao nhất ở pH = 7-7,5. Ở các giá trị pH khác quan sát cĩ sự giảm về mật đợ vi khuẩn từ 23-61%. Đặc biệt khơng thấy sự phát triển của vi khuẩn ở pH = 4 và 9. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Plumb và Vinitnantharat cho thấy khoảng pH thích hợp cho E. ictaluri phát triển trên mơi trường BHI là 7-7,5.
Tất cả các lồi vi khuẩn đều cĩ thời gian thích nghi với mơi trường trước khi trãi qua pha phát triển theo cấp số nhân, khoảng thời gian này dài hay ngắn tùy thuợc vào lồi vi khuẩn. Nghiên cứu trên E. ictaluri cho thấy lồi vi khuẩn
này phát triển chậm hơn so với các lồi vi khuẩn khác. Vì vậy phase lag thường kéo dài hơn 10h. Israil và ctv (2009) theo dõi đường cong sinh trưởng của Vibrio ghi nhận pha lag mất khoảng 6-8h. Nhĩm tác giả này cũng ghi nhận điễn biến đường cong sinh trưởng khác nhau tùy theo loại
mơi trường sử dụng và cĩ bổ sung hay khơng bổ sung các chất ức chế. Việc nghiên cứu đường mơi trường nuơi cấy thích hợp và đường cong sinh trưởng trong đề tài này giúp cho việc quyết định thời gian thu hoạch vi khuẩn chuẩn bị cho phản ứng gây bệnh thực nghiệm, các phản ứng gây sốc hoặc thu vi khuẩn để sản xuất vaccine.
Qua khảo sát cho thấy ở tốc đợ 250 vịng/ phút mặc dù OD cĩ giá trị cao nhất nhưng số khuẩn lạc trên đĩa thạch khơng khác biệt lớn so với tốc đợ khuấy 200 vịng/phút. Sự khác biệt này cĩ thể là do khi đo mật đợ OD cĩ cả vi khuẩn chết trong canh khuẩn. Hơn nữa, với tốc đợ khuấy mạnh trong nồi lên men sẽ làm lượng bọt nhiều và việc điều chỉnh lượng khí trong nồi lên men trở nên khĩ khăn hơn.
V. KẾT LUẬN
E. ictaluri cĩ thể phát triển trên các mơi
trường Nutrient Broth (NB), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Tryptic Soy Broth (TSB) nhưng phát triển tốt nhất trên BHIB.
E. ictaluri phát triển tốt ở pH = 6. Tuy
nhiên, pH vừa thích hợp cho sự phát triển và duy trì đợc lực của của E. ictaluri là 7,0.
Liều vaccine 3 x 109 cĩ khả năng kích thích sinh miễn dịch và bảo hợ cho cá với tỷ lệ chết khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng.
Tốc đợ khuấy 200 vịng/phút, lượng khí thổi vào 6 phút/lít cho sự phát triển và kích thích sinh miễn dịch tốt của E. ictaluri với RPS = 53%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Thị Thanh Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, Trần Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ Hy Lan Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh Thanh, 2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine phịng bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được triển khai tại Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh. Hợi nghị Cơng Nghệ Sinh Học tồn quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.
120 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
Phạm Cơng Thành, 2010. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Luận văn Cao học trường Đại Học Nơng Nơng Tp.HCM.
Tài liệu tiếng Anh
Cerdà-Cuéllar, M., Permin, L., Larsen, J.L. and Blanch, A.R., 2001. Comparison of selective media for the detection of Vibrio vulnificus
in environmental samples. Journal Appllied Microbiology 91, 322-327.
Collines, L.A. and Thune, R.L., 1996. Development of a Defined Minimal Medium for the Growth of
Edwardsiella ictaluri. Applied and Environemntal
Microbiology 62(3), 848-852.
Crumlish, M., Dung, T., Turnbull, J., Ngoc, N. and Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli from the diseased freshwater catfish Pangasius
hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong
Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25, 733-736.
Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J.L. and Fung, D.Y.C., 2006. Impact of sodium chloride on
Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron
microscopy. Food Microbiology 23, 446-452. Jiang, X., and Chai, T. J., 1996. Survival of Vibrio
parahaemolyticus at low temperatures under
starvation conditions and subsequent resuscitation of viable, nonculturable cells. Applied Environmental Microbiology 62, 1300-1305.
Lim, C., Yildirim-Aksoy, M. and Klesius, P.H., 2009. Growth Response and Resistance to Edwardsiella ictaluri of Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Fed Diets Containing Distiller’s Dried Grains with Solubles. Journal of the World Aquaculture Society 40 (2), 182-193.
Natha, J. B., Judith, B. B., and Ronald, L.T., 2009. Edwardsiella ictaluri Encodes an
Acid-Activated Urease That Is Required for Intracellular Replication in Channel Catfish (Ictalurus punctatus) Macrophages. Applied and Environmental Microbiology 75 (21), 6712-6720. Plant, J., 2009. A mutation in Thermosensitive Male
Sterile 1, encoding a heat shock protein with DnaJ and PDI domains, leads to thermosensitive gametophytic male sterility in Arabidopsis. Mar 57(5), 870-82.
Shotts, E. B., and Waltman, W. D., 1990. “A Medium for The Selective Isolation of Edwarsiella ictaluri”. Journal of Wildlife Diseases 26 (2), 214-218. Yeong, Y. S., Van Damme, E. J. M., Sorgeloos, P., and
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect gnotobiotic Artemia franciscana larvae against
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology 22, 318-326.
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos, P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic
Artemia franciscana larvae to abiotic stress
promotes heat shock protein 70 synthesis and entăngces resistance to pathogenic Vibrio campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1), 59-66.
121
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014