PH ẦN II. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BIA
NO 3 Nitrate được nấm men khử thành NO 2
2. CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN 1. Chuyển hóa các loại đường
2.2. Tạo thành và chuyển hóa các chất thứ cấp
Sản phẩm thứ cấp sinh ra trong quá trình lên men có thể hàng trăm chất với hàm lượng từ microgam/lit đến gam/lít. Tuy không nhiều về lượng nhưng có vai trò quyết định trong việc tạo hương và vị của bia.
Hỗn hợp các sản phẩm thứ cấp là hỗn hợp động, sẽ trải qua quá trình biến đổi trong suốt thời gian từ khi bắt đầu lên men đến sau khi bia được ủ chín. Sự chuyển hóa này là cơ sở của quá trình "trưởng thành và chín" của bia.
2.2.1. Rượu bậc cao
Rượu bậc cao còn được gọi là dầu fuse1, là hỗn hợp của các rượu có mạch carbon lớn hơn của ethanol. Quá trình tạo rượu bậc cao về cơ bản bị chi phối bởi thành phần amino acid trong nước nha, đồng thời với sự hiện diện của đường. Có 2 lộ trình tạo rượu bậc cao:
- Lộ trình Ehrlich, theo đó các amino acid được hấp thụ từ dịch wort và khi vào bên trong tế bào, sẽ bị tách loại amin tạo thành α-keto acids. Các acid này sẽ bị decarboxyl hóa tạo thành aldehyde, và từ đó bị khử thành alcohol với ít hơn 1 carbon nguyên tử so với amino acid ban đầu. Hàm lượng cao của một amino acid (so với lượng cần có cho trao đổi chất thông thường của tế bào) sẽ dẫn đến sự gia tăng của rượu bậc cao tương ứng. Ví dụ, sự dư thừa valine có thể tăng cường sự tạo isobutanol trong quá trình lên men; theo lộ trình: oxo-acid → α-oxoisovaleric acid → và aldehyde isobutyraldehyde.
- Lộ trình sinh tổng hợp các amino acid (thông qua amin hóa các bộ khung carbon). Bước cận kề kết thúc của lộ trình này là sự tạo thành α-keto acid và sau đó acid này sẽ được amin hóa để trở thành amino acid, tuy nhiên, nếu các α-keto acid bị decarboxl hóa và khử (như trong lộ trình Ehrlich) thì sẽ tạo rượu bậc cao.
138
Trong cả 2 lộ trình, sự khử cuối cùng của aldehyde thành alcohol có sự can dự của NADH (và tạo thành NAD+). Các yếu tố khác ảnh hưởng đến sự tạo thành rượu bậc cao là: nhiệt độ lên men cao, khuấy trộn và tăng trưởng nấm men quá mức, và đặc tính của chủng nấm men.
Rượu bậc cao chủ yếu trong bia là propanol, iso-butanol (2-methyl propanol), n-butanol, iso-amyl alcohol (3-methyl butanol), và n-amyl alcohol (2-methyl butanol).
Tất cả chúng đều ảnh hưởng đến hương vị bia sản phẩm. Mức tối đa của rượu bậc cao tuỳ thuộc vào từng loại bia: ở bia lên men chìm hàm lượng rượu bậc cao dao động từ 60 đến 90 mg/l; với bia lên men nổi, hàm lượng này có thể đến 100 mg/l. Mức cao hơn sẽ làm hương vị bia mất tính hài hòa.
Khoảng 80% rượu bậc cao hình thành trong quá trình lên men sơ cấp; trong giai đoạn ủ chín có sự gia tăng nhẹ và hầu như không thể giảm được. Muốn điều chỉnh hàm lượng rượu bậc cao chỉ có thể tác động lên quá trình lên men. Các biện pháp làm giảm sự tạo rượu bậc cao gồm tăng mật độ giống, hạ thấp nhiệt độ tiếp giống, sử dụng áp suất dư ngay trong giai đoạn đầu lên men, hạn chế ôxy khuếch tán, đảm bảo đủ amino acid dinh dưỡng cho nấm men.
2.2.2. Các ester
Ester là kết quả của các phản ứng giữa các rượu và acid. Có khoảng 80 ester được phát hiện trong bia, từ C3 (ví dụ ethyl acetate) đến C17 (ví dụ 3-methylbutyl dodecanoate). Tuy nhiên, về lý thuyết, căn cứ trên số lượng các loại rượu và acid trong bia thì số lượng ester có thể lên đến khoảng 3700.
Ester là nhóm chất tạo hương quan trọng nhất trong bia. Tuy nhiên, khi hiện diện với hàm lượng cao chúng sẽ gây cho bia có hưong vị của hoa quả. Một số ester có ngưỡng phát hiện cực thấp, ví dụ ethyl butyrate (0.2 ppm).
Với sự hiện diện vượt trội của ethanol, các ester của nó chiếm phần lớn trong hỗn hợp ester bia, trong đó nhiều nhất là ethyl acetate (10-70 ppm, tùy thuộc vào loại bia). Các loài nấm men dại, ví dụ Hansenula và Pichia, có thể tạo ra ethyl acetate với hàm lượng cao thông qua hô hấp hiếu khí, vì vậy nếu chúng nhiễm vào dịch lên men với số lượng đáng kể sẽ tạo ester với hàm lượng cao bất thường.
Do acetic acid là một sản phẩm phụ của lên men, hiển nhiên ethyl acetate sẽ được tạo thành từ sự ester hóa trực tiếp giữa acid nay với ethanol. Tuy nhiên, ester này hiện diện trong bia với lượng cao hơn nhiều so với ước tính từ quá trình ester hóa hóa học thuần túy. Điều này dẫn đến khám phá rằng quá trình tạo ester có cả sự tham gia của xúc tác của enzyme. Trong đó, các enzyme esterase được nhận diện trong Saccharomyces cerevisiae không có vai trò đáng kể bằng các acyl coenzyme A (đặc biệt là acetyl CoA). Trong nấm men, các hợp chất acyl CoA được tạo ra từ các keto acid, từ sinh tổng hợp các acid béo, hoặc từ sự dị hóa chất béo. Một ví dụ về sự tạo ester với vai trò của acyl CoA là phản ứng tạo ethyl acetate:
C2H5OH + CH3COSCoA → C2H5COOCH3 + CoASH (xúc tác bởi acyl- alcohol transferase).
Nhìn chung, sự tổng hợp ester là hiện tượng phức tạp và không có quan hệ trực tiếp rừ ràng giữa tăng trưởng nấm men và tổng hợp ester. Phần lớn ester được tạo ra trong giai đoạn lên men mạnh, và được tiếp tục bổ sung trong lên men thứ cấp. Bên cạnh đó, cũng có có một số ester có xuất xứ từ các hợp phần bay hơi của houblon.
Các điều kiện lên men có thể làm giảm sự sinh tạo ester: giảm hàm lượng chất khô của dịch đem lên men, giảm độ lên men cuối cùng, tăng lượng không khí bổ sung, nâng nhiệt độ lên men, và tăng áp lực trong quá trình lên men.
139
2.2.3. Aldehyde và ketone
Cả hai nhóm chất chứa carbonyl này hiện diện trong bia với hàm lượng nhỏ, nhưng chỉ các aldehyde là được tạo ra trong quá trình lên men. Khoảng 20 ketone được nhận diện trong bia là các sản phẩm với lượng rất nhỏ và chủ yếu bắt nguồn từ sự phân giải của các sản phẩm houblon. Trong khi đó, khoảng số lượng aldehyde được phát hiện là 30, gồm các hợp chất từ C2 (acetaldehyde) đến C12 (dodecanal).
Acetaldehyde được tìm thấy với hàm lượng cao nhất (4 -15 mg/l). Trong tế bào nấm men thì đây là tiền chất và từ đó ethanol được tạo ra qua một quá trình khử.
Acetaldehye là tác nhân chính gây hương vị đặc trưng của bia non. Trong bia non, hàm lượng aldehyde khoảng 20 đến 40 mg/l và giảm dần đến 8 - 10 mg/l khi bia chín. Sự tạo thành của tất cả các aldehyde tuân theo cùng một nguyên tắc, trong đó mỗi aldehyde được tạo ra bởi sự decarboxyl hóa một α-keto acid tương ứng và xúc tác của enzyme. Ví dụ, acetaldehyde tạo ra từ sự decarboxyl hóa của pyruvic acid (gốc pyruvate) bởi pyruvate decarboxylase.
Hình 11.3. Biến đổi cơ bản trong quá trình lên men nổi (a) và lên men chìm (b).
Mỗi chuyển hóa của α-keto acid thành aldehyde cần một enzyme decarboxylase chuyên biệt, nhưng sự khử của aldehyde thành các rượu tương ứng (đồng thời với việc NADH bị oxy hóa thành NAD+) chỉ cần một enzyme không đặc hiệu (chung) là alcohol dehydrogenase.
Nguồn chủ yếu của aldehyde trong bia là do sự “rò rỉ” ra khỏi tế bào trước khi bị khử thành rượu. Một phần khác được tạo thành bởi sự ôxy hóa các loại rượu trong quá trình lên men phụ và làm chín bia.
140
Hàm lượng acetaldehyde có xu hướng tăng nhanh khi tốc độ lên men cao, nhiệt độ lên men và mật độ men giống cao, đặt áp suất dư sớm (ngay trong giai đoạn đầu lên men), bổ sung không khí thiếu, hoặc dịch lên men bị nhiễm vi sinh vật tạp.
Ngược lại, các yếu tố tạo thuận lợi cho sự tiêu giảm aldehyde gồm các biện pháp nhằm tăng cường độ quá trình lên men thứ cấp (ủ chín), nhiệt độ và nồng độ nấm men trong quá trình ủ chín cao.
2.2.4. Các vicinal diketone
Diacetyl là thành phần quan trọng nhất trong hương bia non. Với hàm lượng cao hơn ngưỡng phát hiện (khoảng 0.1 ppm) sẽ gây cho bia vị lạ và mùi bơ. 2,3- pentandione cũng có tính chất tương tự nhưng ngưỡng tác dụng cao hơn. Cả hai gọi chung là các vicinal diketone.
Diacetyl được gián tiếp tạo ra như một sản phẩm phụ của quá trình tổng hợp valine. Hợp chất chủ chốt của quá trình này là α-acetolactate (AAL), một acetohydroxy acid đóng vai trò là chất trung gian trong sinh tổng hợp valine.
Chất này thoát qua thành tế bào nấm men và được chuyển hóa thành diacetyl trong môi trường dịch lên men bằng con đường hóa học thuần túy, theo phản ứng decarboxyl hóa. Cơ chế này không hoàn toàn độc lập với hoạt động của nấm men, và được tạo thuận lợi khi pH thấp và nhiệt độ môi trường cao. Diacetyl có thể được hấp thụ trở lại tế bào nấm men và được khử thành acetoin và 2,3-butanediol, với sự tham dự của NADH và tạo ra NAD+. Điều này được cho là quan trọng để duy trì cân bằng ôxy hóa-khử trong tế bào trong những giai đoạn sau của quá trình lên men, khi diacetyl được hấp thu. Acetoin và 2,3-butanediol có ngưỡng cảm nhận cao hơn rất nhiều so với diacetyl, do vậy không gây tác dụng tiêu cực đến hương vị bia. Sơ đồ chung của quá trình tạo và khử diacetyl trong lên men được thể hiện ở hình 11.4.
Hình 11.4. Sơ đồ quá trình tạo và khử diacetyl
Ảnh hưởng có hại của diacetyl được biết nhiều đối với bia pale và các bia lên men chỡm. Ngưỡng phỏt hiện của nú trong cỏc bia này là từ 15 - 20 àg/l.
Sự tạo thành 2,3-pentanedione cũng theo cơ chế tương tự với của diacetyl, với tiền chất là α-acetohydroxy butyric. Tuy nhiên, trong khi α-acetolactate tạo ra từ pyruvate trong tế bào bởi xúc tác của enzyme, α-acetohydroxy butyrate là sản phẩm
141
của α-oxo butyrate. Một lưu ý là nấm men đã kết mảng sẽ không có khả năng khử vicinal diketone.
2.2.5. Acid hữu cơ
Trong quá trình lên men có sự tạo thành của một tập hợp nhiều acid hữu cơ, một số trong đó có đóng góp đáng kể vào hương vị sản phẩm. Gồm 2 nhóm:
- Các acid hữu cơ bay hơi: Chủ yếu là acetic, propionic và butyric acid. Acetic acid được tạo thành bởi sự thủy phân của acetyl CoA.
- Các acid hữu cơ không bay hơi: Bao gồm các oxo-acid, như là pyruvic acid, và các sản phẩm của chu trình Krebs, ví dụ succinic acid. Sự tạo thành các oxo-acid liên quan mật thiết với thành phần amino acid trong nước nha.
2.2.6. Hợp chất chứa lưu huỳnh
Trao đổi chất của nấm men sẽ tạo ra hợp chất lưu huỳnh bay hơi, như H2S, mercaptan và các chất khác. Các chất này ngay ở nồng độ nhỏ đã có thể gây hương vị xấu. Khi vượt ngưỡng cảm nhận chúng sẽ thể hiện hương vị của bia non. Sự tác hại của hợp chất lưu huỳnh còn có thể do dịch lên men bị nhiễm các vi sinh vật tạp.
H2S được tạo ra trong quá trình lên men từ các amino acid chứa lưu huỳnh. Sự thiếu các tác nhân sinh trưởng của nấm men sẽ tăng cường quá trình tạo H2S. H2S dễ bay hơi và sẽ thoát khỏi bia trong lên men và ủ chín do tác dụng lôi cuốn của CO2. Lượng H2S thoát ra khỏi bia được tăng cường bởi nhiệt độ cao hoặc tăng chiều cao khối lên men. Sự giảm hàm lượng H2S là cần thiết cho quá trình chín của bia.
Mercaptan là các thioalcohol, trong đó nhóm –OH được thay thế bằng –SH.
Chúng được liệt vào nhóm chất đặc biệt gây hại cho hương vị bia. Mercaptan cũng xuất hiện và gây mùi khó chịu khi bia bị chiếu nắng. Hàm lượng mercaptan tăng đến khi độ lên men đạt khoảng 60 – 70% sau đó giảm dần. Mercaptan có thể phản ứng với ôxy tạo thành các disulphide ít có hại hơn.
Dimethylsulphide (DMS) được tạo ra trong quá trình ươm mầm, sấy, thủy phân.
Nấm men không thể loại trừ DMS, tuy nhiên, một lượng DMS có thể được thoát đi cùng với khí lên men. Việc hạn chế chất này chỉ có thể thực hiện hiệu quả ở khâu sản xuất dịch lên men.
2.2.7. Glycerol
Glycerol được tạo ra trong các giai đoạn đầu của quá trình lên men và là hệ quả của một cơ chế ngăn cản sự hình thành của NADH (tạo bởi sự chuyển hóa nhanh của pyruvate). Nấm men dùng NADH để khử dihydroxyacetone phosphate thành glycerol phosphate. Chất này sau đó bị dephosphor hóa. Phần lớn chất này được dùng cho sinh tổng hợp các cấu trúc nội bào (ví dụ các phospholipid và triglyceride) nhưng một số được bài tiết và có thể hiện diện trong một số loại bia với hàm lượng lên tới 3,5 g/l.
Trong điều kiện hiếu khí, nấm men có thể sử dụng glycerol như một nguồn carbon.