M H: ồm hút OTH : ống tiêu hóa
2.Lμm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
2.1. Vật liệu và hóa chất cần thiết
2.1.1. Thuốc nhuộm đơn
− Dung dịch xanh methylene
− Dung dịch đỏ fuchsin
− Dung dịch tím gentian
2.1.2. Bộ thuốc nhuộm Gram
− Dung dịch tím gentian − Dung dịch lugol − Cồn 90% − Dung dịch đỏ fuchsin 4-5 học sinh dùng chung 1 bộ 2.1.3. Lam kính
Lam kính sạch, khô, không bị x−ớc mỗi học sinh 3-4 lam
2.1.4. Kính hiển vi có vật kính dầu
Mỗi học sinh 1 kính
2.1.5. Canh khuẩn dùng để nhuộm
Cầu khuẩn trộn với trực khuẩn: tụ cầu và E.coli hoặc các cầu khuẩn và trực khuẩn khác
2.1.6. Các vật liệu khác
N−ớc cất rửa tiêu bản, que cấy, diêm, giấy thấm, đèn cồn... cần cho việc nhuộm vi khuẩn.
2.2. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
Làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn phải trải qua 4 b−ớc:
2.2.1. Dμn đồ phiến
Chọn lam kính sạch, không mốc, không x−ớc, không −ớt. Dùng que cấy lấy canh khuẩn (hoặc bệnh phẩm) đặt lên giữa lam kính sao cho vòng que cấy nằm sát lam
kính. Dàn theo đ−ờng xoắn ốc từ trong ra ngoài hoặc theo đ−ờng rích rắc sát nhau, tạo nên một vùng liên tục chứa canh khuẩn có đ−ờng kính khoảng 1 cm. Yêu cầu phải dàn đều, đủ mỏng để việc quan sát trên kính hiễn vi đ−ợc dễ dàng.
2.2.2. Để khô
Sau khi dàn đồ phiến, để tiêu bản khô tự nhiên (tuyệt đối không đ−ợc hơ nóng), vi khuẩn sẽ từ từ gắn vào lam kính mà không bị biến dạng. Nếu tiêu bản ch−a khô mà ta làm b−ớc tiếp theo (cố định) thì vi khuẩn sẽ bị trôi mất (nếu cố định bằng hóa chất) hoặc bị biến dạng (nếu cố định bằng nhiệt độ).
2.2.3. Cố định
Có thể cố định bằng hóa chất, bằng nhiệt hoặc phối hợp cả hai tuỳ thuộc vào từng kỹ thuật nhuộm.
Cố định bằng hóa chất: nhỏ dung dịch cố định phủ lên nơi dàn đồ phiến hoặc ngâm cả lam kính vào trong dung dịch cố đinh với thời gian thích hợp.
Cố định bằng nhiệt: lam kính đ−ợc đ−a qua đ−a lại, cắt ngang ngọn đèn cồn 3-4 lần sao cho nhiệt độ lên khoảng 800C.
Cố định có 3 tác dụng:
− Gắn chặt vi khuẩn vào lam kính
− Giết chết vi khuẩn
− Chuẩn bị cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn (do vi khuẩn chết không còn khả năng thấm chọn lọc các chất).
2.2.4. Nhuộm
Có 2 ph−ơng pháp nhuộm:
2.2.4.1.Ph−ơng pháp nhuộm đơn
Nhuộm đơn là ph−ơng pháp dùng một loại hóa chất màu để nhuộm vi khuẩn. Hóa chất nhuộm màu gì thì vi khuẩn sẽ bắt màu đấy. Nhuộm đơn chỉ cho ta biết đ−ợc hình thể, kích th−ớc và cách sắp xếp của vi khuẩn mà không cho phép phân biết đ−ợc tính chất bắt màu khác nhau giữa các vi khuẩn có bản chất không giống nhau.
Sau khi tiêu bản đã đ−ợc cố định, nhỏ thuốc nhuộm (xanh methylene hoặc đỏ fuchsin...) phủ kín đồ phiến. Sau 1 phút đổ thuốc nhuộm, rửa phiến kính d−ới vòi n−ớc chảy nhẹ, để khô và soi trên kính hiển vi.
2.2.4.2. Ph−ơng pháp nhuộm kép
Nhuộm kép là ph−ơng pháp dùng hai loại hóa chất mầu trở lên để nhuộm vi khuẩn. Trên vi tr−ờng có thể thấy các vi khuẩn khác nhau bắt màu khác nhau, tuỳ từng tính chất của vi khuẩn.
Trong ph−ơng pháp nhuộm kép có nhiều kỹ thuật nhuộm khác nhau nh−: kỹ thuật Ziehl Neelssen nhuộm vi khuẩn lao, kỹ thuật Neisser nhuộm vi khuẩn bạch hầu, kỹ thuật nhuộm thấm bạc nhuộm vi khuẩn giang mai ... Trong phạm vi của bài, chỉ giới thiệu kỹ thuật nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật cơ bản nhất trong vi khuẩn học. Kỹ thuật này do Christian Gram xây dựng năm 1884. Nhờ kỹ thuật nhuộm Gram, ng−ời ta không những biết đ−ợc hình thể, kích th−ớc và cách sắp xếp của vi khuẩn mà còn biết đ−ợc tính chất bắt màu khác nhau của các vi khuẩn không giống nhau, giúp chúng ta có h−ớng chẩn đoán tốt, phân biệt đ−ợc vi khuẩn Gram d−ơng và vi khuẩn Gram âm.
− Kỹ thuật nhuộm Gram
Sau khi dàn đồ phiến, để khô, cố định tiêu bản bằng nhiệt, tiến hành các b−ớc theo thứ tự sau:
+ Nhỏ dung dịch tím gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1 - 2 phút
+ Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản d−ới vòi n−ớc chảy nhẹ
+ Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây
+ Đổ dung dịch lugol, rửa n−ớc
+ Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 90% lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia. Khi thấy màu tím trên lam kính vừa phai hết thì rửa n−ớc ngay. Thời gian tẩy màu phụ thuộc vào độ dày hay mỏng của vi khuẩn dàn trên lam kính.
+ Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 – 2 phút
+ Rửa n−ớc kỹ, để khô tiêu bản, soi kính hiễn vị.
− Nhận định kết quả:
Trên vi tr−ờng, các vi khuẩn bắt màu tím là Gram d−ơng các vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram âm.
Tự L−ợng giá
1. Vẽ hình thể, tính chất bắt màu và tính kích th−ớc gần đúng của 6 vi khuẩn đã đ−ợc xem trong buổi thực tập
2. Nhuộm 1 tiêu bản đơn.
L−ợng giá * TT Các b−ớc thực hiện chủ yếu Hệ số 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Chuẩn bị lam kính, canh khuẩn và các dụng cụ khác Dàn đồ phiến
Để khô tự nhiên Cố định bằng nhiệt độ
Nhỏ dung dịch tím Gentian duy trì 1-2 phút Rửa n−ớc nhỏ Lugol duy trì 30 giây
Rửa n−ớc
Tẩy màu bằng cồn 90% Rửa n−ớc
Nhỏ dung dịch Fuchsin duy trì 1-2 phút Rửa n−ớc kỹ
Để khô, soi kính
Nhận định kết quả nhuộm phân biệt vi khuẩn bắt màu tím và vi khuẩn bắt màu đỏ
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 Tổng điểm
* 2: Làm tốt; 1: làm đ−ợc ; 0: làm không đạt yêu cầu hoặc không làm
Đọc và nhận định tiêu bản: chỉ đ−ợc vi khuẩn bắt màu Gram d−ơng và vi khuẩn bắt màu Gram âm.