- Kỹ thuật ELISA Sandwich
TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP
76
cỏc vựng khỏc nhau, bao gồm Bangkok, Bắc Thỏi Lan, Đụng Nam Thỏi Lan và Nam Thỏi Lan, kết quả xỏc định phõn type cho thấy phõn typ CRF01_AE chiếm tới 97,3%, trong khi đú phõn type B chỉ chiếm 2,7%. Khụng phỏt hiện thấy cỏc phõn type khỏc. Bản đồ phõn bố của cỏc phõn typ HIV trờn thế giới [104] cũng cho thấy khu vực Đụng Nam Á là khu vực lưu hành chớnh của
phõn type CRF01_AE (Hỡnh 3.2.)
Hỡnh 3.2. Sự phõn bố của cỏc phõn type HIV trờn thế giới. Khu vực Đụng
Nam Á (màu hồng) là khu vực lưu hành chớnh của phõn type CRF01_AE và B [104].
Cỏc cặp primer được thiết kế đặc hiệu cho phõn type B và CRF01_AE trờn gen p24 và tiến hành xỏc định phõn typ bằng Nested PCR. Kết quả cho thấy cỏc mẫu cú kết quả dương tớnh với phõn type B thỡ hoàn toàn õm tớnh với phõn type CRF01_AE và ngược lại. Tất cả 240 mẫu bệnh phẩm đều dương
tớnh với hai phõn type hoặc B hoặc CRF01_AE, khụng cú mẫu nào hoàn toàn õm tớnh. Như vậy, những cặp mồi mà chỳng tụi thiết kế để tiến hành định type là rất đặc hiệu, khụng cú mẫu bệnh phẩm nào vừa dương tớnh với phõn type B lại vừa dương tớnh với phõn type CRF01_AE.
77
Hỡnh 3.3. Sản phẩm Nested PCR với cặp mồi của phõn type B và phõn type
CRF01_AE. M: DNA marker. a1, a2, b1, b2; b5, b6; b9, b10; b13, b14: Sản phẩm PCR với cặp mồi của phõn type B. b3, b4; b7, b8; b11, b12; b15, b16: Sản phẩm PCR với cặp mồi của phõn type CRF01_AE.
Để khẳng định một cỏch chớnh xỏc, chỳng tụi tiến hành lựa chọn một số
mẫu để kiểm tra lại trỡnh tự. Kết quả giải trỡnh tự cho thấy xỏc định phõn type bằng kỹ thuật Nested PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trờn những vựng gen đặc trưng cho mỗi phõn type là kỹ thuật cho kết quả chấp nhận
được, giỏ thành hạ, tiến hành nhanh và cú thể thực hiện được trờn số mẫu lớn.
Kết quả giải trỡnh tự gen p24 của phõn type B:
ID HIV-1 subtype B p24 gene PRELIMINARY; DNA; 608 BP. SQ SEQUENCE 608 BP; 225 A; 123 C; 139 G; 121 T;
GGGCAAATGG TACATCAAGC CATATCACCT AGAACTTTAA ATGCATGGGT AAAAGTAGTA GAAGAGAAGG CTTTCAGCCC AGAAGTAATA CCCATGTTTT CAGCATTATC AGAAGGAGCC GAAGAGAAGG CTTTCAGCCC AGAAGTAATA CCCATGTTTT CAGCATTATC AGAAGGAGCC ACCCCACAAG ATCTAAATAC CATGCTAAAC ACAGTGGGGG GACATCAAGC AGCCATGCAA ATGTTAAAAG AGACCATCAA TGAGGAAGCT GCAGAATGGG ATAGATTGCA TCCAGTGCAT GCAGGGCCTA TTGCACCAGG CCAGATGAGA GAACCAAGGG GAAGTGACAT AGCAGGAACT ACTAGTACCC TTCAGGAACA AACAGGATGG ATGACACATA ATCCACCTAT CCCAGTAGGA GAAATCTATA GAAGATGGAT AGTCCTGGGA TTAAATAAAA TAGTAAGAAT GTATAGCCCT ACCAGCATTC TGGACATAAG ACAAGGACCA AAGGAACCCT TTAGAGACTA TGTAGACCGA TTCTATAAAA CTCTGAGAGC CGAGCAAGCT TCACAAGAGG TAAAAAATTG GATGACAGAA ACCTTGTTGG TCCAAAATGC GAACCCAGAT TGTAAGACTA TTTTAAAAGC ATTGGGACCA GCAGCTAC M 1 2 600b p 564bp 831bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Kb 0,25 - 0,50- 0,75 - a b
78
Trỡnh tự gen p24 phõn type B đó được đăng ký trong Ngõn hàng dữ liệu gen Quốc tế (GenBank) với số đăng ký AM944368.
Kết quả giải trỡnh tự gen p24 của phõn type CRF01_AE:
ID HIV-1 subtype CRF01_AE p24 gene PRELIMINARY; DNA; 588 BP. SQ SEQUENCE 588 BP; 217 A; 113 C; 137 G; 121 T;
CACAAGGGCA AATGGTACAT CAGCCTTTAT CACCTAGAAC TTTGAATGCA TGGGTAAAAG TAGTAGAAGA AAAGGGTTTT AACCCAGAAG TAATACCCAT GTTCTCAGCA TTATCAGAGG TAGTAGAAGA AAAGGGTTTT AACCCAGAAG TAATACCCAT GTTCTCAGCA TTATCAGAGG GAGCCACCCC ACAAGATTTA AATATGATGC TAAATATAGT GGGGGGACAT CAGGCAGCAA TGCAAATGTT AAAAGAAACC ATCAATGAGG AAGCTGCAGA ATGGGATAGA GTACACCCAG TACATGCAGG GCCTATTCCA CCAGGCCAGA TGAGGGAGCC AAGGGGAAGT GACATAGCAG GAACTACTAG TACCCTTCAA GAACAAATAG GATGGATGAC AAACAATCCA CCTATCCCAG TGGGAGACAT CTATAAAAGG TGGATAATCC TGGGATTGAA TAAAATAGTA AGAATGTATA GCCCTGTTAG CATTTTGGAC ATAAGACAAG GGCCAAAAGA GCCCTTCAGA GACTATGTAG ATAGGTTCTA TAAAACTCTC AGAGCGGAAC AAGCTACACA GGAGGTAAAA AACTGGATGA CAGAAACCTT GCTAGTCCAA AATGCGAATC CAGACTGTAA GTCCATTT
Trỡnh tự gen p24 phõn typ CRF01_AE đó được đăng ký trong Ngõn
hàng dữ liệu gen Quốc tế (GenBank) với số đăng ký FM162180.
So sỏnh trỡnh tự gen p24 phõn type B với phõn type CRF01_AE thu
được độ tương đồng rất thấp, chỉ đạt 89% : P24AE - CACAAGGGCAAATGGTACATCAGCCTTTATCACCTAGAACTTTGAATGCA -50 ||||||||||||||||| | |||||||||||||||| |||||| P24B - GGGCAAATGGTACATCAAGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCA -45 P24AE - TGGGTAAAAGTAGTAGAAGAAAAGGGTTTTAACCCAGAAGTAATACCCAT -100 |||||||||||||||||||| |||| ||| | |||||||||||||||||| P24B - TGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCAT -95 P24AE - GTTCTCAGCATTATCAGAGGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATATGATGC -150 ||| |||||||||||||| |||||||||||||||||| |||||| |||| P24B - GTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATCTAAATACCATGC -145 P24AE - TAAATATAGTGGGGGGACATCAGGCAGCAATGCAAATGTTAAAAGAAACC -200 |||| | ||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||| ||| P24B - TAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACC -195
79 P24AE - ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTACACCCAGTACATGCAGG -250 P24AE - ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTACACCCAGTACATGCAGG -250 |||||||||||||||||||||||||||||| | || ||||| |||||||| P24B - ATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGATTGCATCCAGTGCATGCAGG -245 P24AE - GCCTATTCCACCAGGCCAGATGAGGGAGCCAAGGGGAAGTGACATAGCAG -300 ||||||| |||||||||||||||| || |||||||||||||||||||||| P24B - GCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAG -295 P24AE - GAACTACTAGTACCCTTCAAGAACAAATAGGATGGATGACAAACAATCCA -350 ||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||| | |||||| P24B - GAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAACAGGATGGATGACACATAATCCA -345 P24AE - CCTATCCCAGTGGGAGACATCTATAAAAGGTGGATAATCCTGGGATTGAA -400 ||||||||||| ||||| ||||||| ||| |||||| |||||||||| || P24B - CCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAGAAGATGGATAGTCCTGGGATTAAA -395 P24AE - TAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTGTTAGCATTTTGGACATAAGACAAG -450 ||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||||||||||||| P24B - TAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAG -445 P24AE - GGCCAAAAGAGCCCTTCAGAGACTATGTAGATAGGTTCTATAAAACTCTC -500 | ||||| || ||||| |||||||||||||| | |||||||||||||| P24B - GACCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTG -495 P24AE - AGAGCGGAACAAGCTACACAGGAGGTAAAAAACTGGATGACAGAAACCTT -550 ||||| || |||||| |||| ||||||||||| ||||||||||||||||| P24B - AGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTT -545 P24AE - GCTAGTCCAAAATGCGAATCCAGACTGTAAGTCCATTT -588 | | |||||||||||||| ||||| |||||| | |||| P24B - GTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGG -595 P24B - GACCAGCAGCTAC -608 Identity: 89.12%
Khi dịch mó sang protein và so sỏnh trỡnh tự protein P24 CRF01_AE và P24B thỡ độ tương đồng cũng chỉ đạt 91%.
80 P24AE_PROT- QGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEEKGFNPEVIPMFSALSEGATPQDLNMML -50 P24AE_PROT- QGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEEKGFNPEVIPMFSALSEGATPQDLNMML -50 |||||| ||||||||||||||| | |||||||||||||||||||| || P24B_PROT - GQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTML -49 P24AE_PROT- NIVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIPPGQMREPRGSDIAG -100 | |||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||||| P24B_PROT - NTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAG -99 P24AE_PROT- TTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQG -150 |||||||| |||| ||||||| || ||| |||||||||||| |||||||| P24B_PROT - TTSTLQEQTGWMTHNPPIPVGEIYRRWIVLGLNKIVRMYSPTSILDIRQG -149 P24AE_PROT- PKEPFRDYVDRFYKTLRAEQATQEVKNWMTETLLVQNANPDCKSI -195 ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | P24B_PROT - PKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALG -199 P24B_PROT - PAA -202 Identity: 91.28%
Như vậy, cõu hỏi đặt ra là nếu phõn type lưu hành chủ yếu ở nước ta là CRF01_AE mà cỏc kit chẩn đoỏn lại được sản xuất từ cỏc khỏng nguyờn của
phõn type B, phõn type lưu hành chủ yếu ở chõu Âu, Bắc Mỹ và chõu Úc thỡ liệu độ đặc hiệu và độ nhạy của kit chẩn đoỏn cú đảm bảo hay khụng? Và sau này nếu như cú vắc xin phũng chống HIV/AIDS được nghiờn cứu thành cụng trờn phõn type B thỡ liệu khả năng bảo vệ cho cơ thể được tiờm vắc xin cú đảm bảo hay khụng?
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});