- Kỹ thuật ELISA Sandwich
1.10.6. Nghiờn cứu cỏc protein tỏi tổ hợp để tạo kit chẩn đoỏn
Từ năm 1984, sau khi cú cụng trỡnh cụng bố của nhúm tỏc giả về phỏt hiện, phõn lập và nuụi cấy được HIV trờn tạp chớ Science [70], thỡ việc nghiờn cứu để tạo ra cỏc kit chẩn đoỏn HIV cũng được nhiều phũng thớ nghiệm quan tõm nghiờn cứu [56]. Tuy nhiờn, chế tạo kit chẩn đoỏn HIV bằng cỏc khỏng nguyờn tự nhiờn cú cỏc điều bất lợi sau đõy:
- Nuụi cấy HIV là một cụng việc làm cú nguy cơ lõy nhiễm cao cho người trực tiếp sản xuất.
- Quỏ trỡnh tinh chế là rất khú khăn và khú thu được lượng lớn khỏng nguyờn tự nhiờn nờn giỏ thành kit chẩn đoỏn cao.
- Rất khú cú thể tỏch riờng cỏc khỏng nguyờn đặc hiệu cú tớnh sinh miễn dịch cao vỡ vậy cần phải phõn tỏch protein bằng điện di gel
polyacrylamide rồi chuyển sang màng và dựng để phỏt hiện khỏng thể
đặc hiệu khỏng HIV (kỹ thuật Western blot).
Chớnh vỡ vậy, việc nghiờn cứu tạo ra cỏc protein tỏi tổ hợp cú tớnh đặc hiệu cao để tạo kit chẩn đoỏn HIV đó được nhiều phũng thớ nghiệm trờn thế giới quan tõm. Ngay từ những năm của thập niờn 1980, đó cú nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu tạo protein tỏi tổ hợp của HIV trong E. coli. Vớ dụ như nhúm nghiờn cứu của Ghrayeb J et al. [36] đó tạo ra được khỏng nguyờn P24 tỏi tổ dạng tinh chế từ E. coli và ứng dụng để phỏt hiện được khỏng thể khỏng HIV trong huyết thanh bệnh nhõn. Năm 1987, cỏc khỏng nguyờn tỏi tổ hợp P24, GP120 và GP41 cũng đó được biểu hiện thành cụng trong E. coli. Cỏc khỏng nguyờn tỏi tổ hợp tinh chế đó được sử dụng để phỏt hiện khỏng thể khỏng HIV bằng ELISA [44]. Nhúm của cỏc tỏc giả Shoeman RL et al. [74] cũng đó biểu hiện trong E. coli, thu nhận và tinh sạch cỏc protein P24, Gp41 và GP120 và chế tạo thành cụng cỏc bộ sinh phẩm chẩn đoỏn HIV bằng ELISA và Western blot. Chỉ những peptide được biểu hiện trong E. coli từ những epitope chọn lọc từ cỏc vựng nhất định của gen p24, gp120 và gp41 cũng cú ỏi lực và tớnh
39
đặc hiệu cao với khỏng thể khỏng HIV và được sử dụng để phỏt hiện HIV
bằng ELISA [78], [52], [72], [50]. Cỏc tỏc giả Nhật Bản cũng đó thành cụng trong việc tạo ra một lượng lớn protein P24 tỏi tổ hợp tinh sạch biểu hiện từ
E. coli để chế tạo kit chẩn đoỏn [76]. Bằng việc cải tiến hệ vector biểu hiện,
cỏc nhà khoa học Phỏp đó biểu hiện trong E. coli và tinh sạch chỉ bằng một bước cú thể thu được protein tỏi tổ hợp của HIV với lượng 40mg/lit mụi trường nuụi cấy [33]. Cỏc nhà khoa học Ấn Độ cũng đó đặc biệt thành cụng
trong việc biểu hiện, thu nhận và tinh chế cỏc protein tỏi tổ hợp của HIV trong
E. coli và ứng dụng trong chế tạo kit chẩn đoỏn [38], [37]. Cỏc nhà khoa học
Nga đó chọn vựng epitope V3 của gen gp120 để biểu hiện trong E. coli và thu
được protein đặc hiệu cú ỏi lực cao với HIV và cú thể sử dụng để phỏt triển
kit chẩn đoỏn HIV [71]. 1.11. ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS
Cho tới nay, thế giới vẫn chưa cú vắc xin phũng chống HIV/AIDS. Tuy nhiờn, việc điều trị cũng như dự phũng HIV bằng cỏc thuốc khỏng retrovirus cú thể làm giảm nguy cơ phỏt bệnh trong trường hợp mới nhiễm [35]. Hiện nay, phương phỏp điều trị HIV bao gồm phỏc đồ điều trị tớch cực (highly
active antiretroviral therapy viết tắt là HAART). Phương phỏp điều trị này đó mang lại lợi ớch cực kỳ to lớn cho những bệnh nhõn nhiễm HIV được tiếp nhận phỏc đồ điều trị này từ năm 1996, khi thuốc khỏng HIV trờn cơ sở ức
chế protease của virus được đưa vào sử dụng [68]. Phương phỏp điều trị tốt nhất hiện nay là kết hợp 3 loại thuốc, ớt nhất thuộc 2 dạng khỏng retrovirus, 2 loại thuộc dạng nucleotide analogue ức chế enzyme phiờn mó ngược (NARTIs) cộng với một loại thuốc hoặc là ức chế protease hoặc là ức chế enzyme phiờn mó ngược nhưng khụng thuộc dạng nucleotide (NNRTI).
* Xỏc định quần thể lympho T
Đỏnh giỏ mức giảm tế bào lympho tuyệt đối giỳp điều trị dự phũng
40
Số lượng TCD4 giảm dần trong tiến triển bệnh. Bỡnh thường, số lượng TCD4 là 450-1.280/ mm3. Nếu TCD4 < 400/ mm3: cú suy giảm miễn dịch, TCD4 < 200/ mm3: cú suy giảm miễn dịch trầm trọng.
Số lượng TCD8 cú thể tăng trong giai đoạn đầu của bệnh. Bỡnh thường, số lượng TCD8 là 258-800/ mm3. Tỷ lệ TCD4/TCD8 giảm, bỡnh thường tỷ lệ này dao động từ 1,4-2,2. Số lượng TCD4, lymphocyte toàn phần và tỷ lệ TCD4/TCD8 giảm cú ý nghĩa quan trọng nhất để chẩn đoỏn xỏc định nhiễm
HIV chuyển sang AIDS.
* Cỏc phản ứng miễn dịch
Phản ứng tăng sinh lymphocyte với cỏc chất kớch thớch phõn bào
(PHA,ConA, KN) giảm. Phản ứng tuberculin và candidin õm tớnh.
* Rối loạn miễn dịch
Tăng sinh cỏc Ig đa clon, IgG, IgA. Beta-2-Microglobulin tăng.
* Chẩn đoỏn AIDS trờn lõm sàng
Theo WHO, xỏc định bệnh AIDS trờn lõm sàng khi cú ớt nhất hai dấu hiệu chớnh phối hợp ớt nhất với một dấu hiệu phụ [2], [5], [7].
Cỏc dấu hiệu chớnh Cỏc dấu hiệu phụ
- Sụt cõn > 10% trọng lượng cơ thể
- Ỉa chảy mạn trờn 1 thỏng. - Sốt dai dẳng trờn 1 thỏng.
- Ho dai dẳng trờn 1 thỏng. - Viờm da ngứa toàn thõn. - Herpes, Zona tỏi phỏt.
- Nhiễm Candida ở hầu họng tỏi phỏt. - Bệnh hạch lympho toàn thõn kộo dài
* Quan điểm điều trị HIV/AIDS
- Chăm súc giảm nhẹ tạm thời cỏc triệu chứng. - Điều trị khỏng Retrovirus.
41
CHƯƠNG II