- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.12.Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.12.Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
Protein tỏi tổ hợp được biểu hiện ra ở dạng inclusion bodies. Sử dụng phương phỏp tinh sạch bằng Kit ProBondTM của hóng Invitrogen cú thể chuyển protein từ dạng khụng hũa tan thành dạng hoà tan. Điều này hết sức quan trọng cho mục đớch tạo ra cỏc protein tỏi tổ hợp để phỏt triển cỏc kit
chẩn đoỏn. Quỏ trỡnh tinh sạch được thực hiện theo cỏc bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị dịch tế bào trước khi đưa lờn cột:
1. Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer (Gu.HCl 6M, NaH2PO4 200mM, NaHPO4 200mM, NaCl 500mM, H2O, chỉnh pH 7,8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N).
2. Ly tõm huyền dịch tế bào (100 ml) đó kiểm tra khả năng biểu hiện ra protein tỏi tổ hợp ở tốc độ 5000 vũng trong thời gian 10 phỳt, thu
cặn tế bào.
3. Hoà lại tế bào trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH 7,8
4. Làm tan cặn tế bào bằng cỏch lắc nhẹ trờn mỏy Vortex ở nhiệt độ phũng trong thời gian 5 phỳt.
5. Phỏ màng tế bào bằng mỏy siờu õm trong thời gian 15 – 20 phỳt (để huyền dịch tế bào trờn đỏ, phỏ tế bào bằng mỏy Labsonic với đầu phỏ
mẫu 40T đường kớnh 4-mm, dài 127-mm ở tần số 20 kHz và õm lượng 40 W theo chu kỳ: chạy mỏy 30 giõy, dừng 20 giõy).
6. Ly tõm dịch phỏ tế bào ở tốc độ 10.000 vũng trong thời gian 15
phỳt, thu dịch nổi, loại xỏc tế bào.
Bước 2: Chuẩn bị cột
1. Lắc đều để ProBond TM Resin tạo thành huyền dịch đồng nhất. 2. Dựng pipet hỳt 2 ml huyền dịch Nikel Resin đưa lờn cột tinh sạch
59
3. Rửa cột bằng 6 ml nước khử ion.
4. Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer ( Urea 8M, NaCl 500mM, NaHPO4 20 mM, NaH2PO4 20mM, chỉnh pH 7,8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N).
5. Hoà lại Resin bằng cỏch đảo cột bằng tay. Sau đú để cột lại theo
phương thẳng đứng để Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột 6. Lặp lại (4) và (5).
Bước 3: Đưa protein lờn cột và đẩy ra khỏi cột 1. Đưa 8 ml dịch phỏ tế bào sau ly tõm lờn cột.
2. Lắc nhẹ cột trờn mỏy vortex trong thời gian 15 – 30 phỳt ở nhiệt độ phũng. Sau đú để cột lại theo phương thẳng đứng để huyền dịch
Nikel Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.
3. Rửa cột bằng 4 ml Denaturing Binding Bufer pH 7,8, lặp lại 3 lần. 4. Rửa cột bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (Urea 8M, NaHPO4
20mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 500mM, chỉnh pH 6,0 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N và lọc qua màng màng lọc khuẩn 0,45mm). Lặp lại 3 lần.
5. Rửa cột bằng 8 ml Native Wash Buffer. Dung dịch này được chuẩn bị như sau:
+ Chuẩn bị dung dịch Imidazole 3M, pH 6,0 - Imidazole 3M
- NaCl 500mM - NaHPO4 20 mM - NaH2PO4 20mM
- Chỉnh pH 6,0 bằng HCl 1N
+ Chuẩn bị dung dịch Native Purification Buffer 5X - NaH2PO4 250mM
60
- Chỉnh pH 8,0 bằng NaOH 1N (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ dung dịch Native Puriffication Buffer 5X pha loóng nồng
độ thành dung dịch Native Puriffication Buffer 1X
+ Chuẩn bị dung dịch Native Wash Buffer - Native Puriffication Buffer 1X : 50 ml - Imidazole 3M, pH 6,0 : 335 ml - Chỉnh pH 8,0 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N
6. Đẩy protein tỏi tổ hợp ra khỏi cột bằng 12 ml Native Elution Buffer,
thu 12 phõn đoạn, mỗi phõn đoạn 1 ml. Thành phần của dung dịch Native Elution Buffer như sau:
+ Native Purification Buffer 1X : 41,25 ml + Imidazole 3M, pH 6,0 : 3,75 ml Chỉnh pH 8,0 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N
7. Kiểm tra protein sau khi tinh sạch bằng điện di trờn gel
polyacrylamide 12,5%. 2.2.13. Phương phỏp Western blot
Phương phỏp Western blot để thử khả năng phản ứng của khỏng thể
trong huyết thanh bệnh nhõn và khỏng thể sản xuất trờn thỏ khỏng cỏc protein tỏi tổ hợp được thực hiện theo (Towbin et al., 1979). Protein tỏi tổ hợp điện di trờn gel polyacrylamide 12,5% sau đú được chuyển sang màng polyvinyl-
idene-difluoride (PVDF), nhuộm màng tạm thời bằng dung dịch Ponceau 0,1% để đỏnh dấu vị trớ của băng protein tỏi tổ hợp. Phủ màng bằng BSA 5% trong dung dịch đệm Tween Tris-HCl Buffed Solution (TTBS). Dựng màng này để phỏt hiện khỏng thể khỏng HIV tự nhiờn trong huyết thanh bệnh nhõn. Huyết thanh bệnh nhõn được pha loóng 1000 lần trong dung dịch đệm TTBS chứa 1% gelatin rồi cho phản ứng với protein tỏi tổ hợp trờn màng. Khỏng thể khỏng HIV tự nhiờn được phản ứng với cộng hợp khỏng IgG người gắn
61
enzyme Horseradish peroxidase (HRP). Phản ứng hiện màu được thực hiện
với cơ chất 4-chloronaphtol.