- Kỹ thuật ELISA Sandwich
KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
3.5.1. Thiết kế vectơ biểu hiện mang gen mó hoỏ protein gp
Sau khi khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP41K1 và GP41K2, sản phẩm PCR (gp41) được kiểm tra trờn gel agarose 1%. Kết quả
(hỡnh 3.13.A) cho thấy, đoạn gen mó húa protein GP41 đó được nhõn lờn một cỏch đặc hiệu, chỉ tạo ra một băng DNA duy nhất, khụng cú sản phẩm phụ với kớch thước khoảng 500 bp đỳng như theo tớnh toỏn lớ thuyết. Đoạn gen này sau đú được thiết kế vào vector biểu hiện pET32a+ như trỡnh bày ở phần trờn. Trỡnh tự đoạn gen mó húa GP41 và khung đọc mở của gen trong vector pET32a+ được phõn tớch bằng cắt với enzyme giới hạn BamHI và XhoI và xỏc
định trỡnh tự. Chỳng tụi đó chọn được 2 dũng plasmid tỏi tổ hợp mang gen gp41, được gắn đỳng khung đọc trong vector biểu hiện (dũng số 3 và 6 tương
ứng với giếng số 3 và 6 ở hỡnh 3.13.B). Để khẳng định một cỏch chớnh xỏc,
đoạn gen gắn trong vectơ tỏi tổ hợp này được tiến hành xỏc định trỡnh tự và dịch mó sang protein. Kết quả cho thấy trỡnh tự gen mó hoỏ khỏng nguyờn GP41 sau khi gắn vào vectơ biểu hiện hoàn toàn trựng khớp với trỡnh tự gen
93
FN600552, và dịch mó ra protein hoàn toàn thụng suốt khụng tạo mó kết thỳc trong gen. Vector tỏi tổ hợp này được dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Hỡnh 3.13. Chọn lọc cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp pET32a(+) mang gen gp41
bằng điện di trờn gel agarose 1%. A. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen gp41 bằng cặp mồi GP41K1 và GP41K2. M: thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), 1: sản phẩm PCR (gp41); B. Cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp (repET-gp41) cắt kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn. M: thang DNA chuẩn 1 kb, 1-6: cỏc dũng plasmid từ số 1-6 cắt bằng BamH I và Xho I.