- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.4.Phương phỏp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.4.Phương phỏp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt
sốc nhiệt
Sau khi gắn đoạn DNA khuếch đại vào plasmid, sản phảm gắn được
biến nạp vào E. coli, quỏ trỡnh biến nạp được tiến hành qua cỏc bước sau:
+ Tạo tế bào khả biến:
- Tế bào E. coli được nuụi qua đờm trong 5 ml mụi trường LB lỏng.
- Pha loóng huyền dịch tế bào đó nuụi cấy theo tỷ lệ 1/100 trong 5 ml mụi trường LB.
Nuụi lắc ở 370C, 200 vũng/phỳt. Sau 2 giờ tiến hành kiểm mật độ tế bào ở
bước súng 600 nm. OD600 đạt giỏ trị từ 0,6 đến 1 là đạt yờu cầu. - Chuyển 1 ml dịch tế bào sang ống Eppendorf sạch.
- Để trờn đỏ 10 phỳt.
- Ly tõm thu sinh khối ở 40C, tốc độ 5000 vũng /phỳt trong 10 phỳt. - Hũa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 1 ml CaCl2 100 mM ở 40C. - Ly tõm thu tế bào, loại bỏ dịch nổi.
- Hoà cặn tế bào thành huyền dịch trong 50 àl CaCl2 100 mM. Để huyền dịch tế bào trờn đỏ 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp.
+ Biến nạp:
- Trộn sản phẩm gắn (khoảng 10-50 ng) với tế bào khả biến sau đú để đỏ 30 phỳt.
- Sốc nhiệt ở 420C, 1 phỳt 30 giõy. - Đặt trong đỏ 2 phỳt.
- Bổ sung 450àl mụi trường LB lỏng, sau đú nuụi lắc ở tốc độ 200 vũng/phỳt, 370C trong 1 giờ. Cuối cựng cấy trải trờn 2 đĩa petri chứa mụi trường LB đặc + với chất khỏng sinh ampixilin (nồng độ 100àl /ml), đĩa thứ nhất 50 àl và đĩa
52
thứ hai 150 àl huyền dịch vi khuẩn đó biến nạp, để cỏc đĩa đó cấy vi khuẩn ở tủ ấm 370C qua đờm .
2.2.5. Phương phỏp tỏch chiết plasmid từ E. coli
Sau khi biến nạp vào tế bào E. coli, plasmid được tỏch chiết lại để sàng lọc cỏc plasmid tỏi tổ hợp.
Quy trỡnh:
- Cấy chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa 5ml mụi trường LB lỏng được bổ sung khỏng sinh tương ứng với nồng độ phự hợp. Nuụi lắc qua đờm ở 370C, 200 vũng/phỳt. Chia dịch nuụi tế bào và cỏc
ống Eppendoft 1,5 ml.
- Ly tõm huyền dịch thu tế bào với tốc độ 5000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt, thu cặn tế bào.
- Hoà cặn vi khuẩn trong 150 àl Sol 1, vortex. - Bổ sung 150 àl Sol II, đảo nhẹ, để trờn đỏ. - Bổ sung 150 àl Sol III, đảo nhẹ, để trờn đỏ. - Thờm 450 àl chloroform:isoamylalcohol (24:1).
- Ly tõm với tốc độ 12.000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt. - Hỳt 400 àl dịch nổi sang ống Eppendort loại 1,5ml mới. - Bổ sung 40 àl NaOAC 3M, pH = 5,2 và 1ml cồn tuyệt đối. - Tủa ở - 200C trong thời gian 2 giờ.
- Ly tõm với tốc độ 12000 vũng/phỳt trong thời gian 30 phỳt, thu tủa. - Rửa bằng 1ml cồn 70%.
- Ly tõm với tốc độ 12000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt, thu tủa. - Làm khụ
- Hoà lại vào 40 àl TE – RNase. - Ủ ở 370C trong thời gian 1 giờ.
53