- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.19.Phương phỏp thiết kế vector biểu hiện gen mó hoỏ khỏng nguyờn P24 của phõn type CRF01_AE
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.19.Phương phỏp thiết kế vector biểu hiện gen mó hoỏ khỏng nguyờn P24 của phõn type CRF01_AE
P24 của phõn type CRF01_AE
Plasmid chứa gen mó húa protein P24 đó tạo dũng được sử dụng làm khuụn để khuếch đại gen mó húa protein P24 bằng cặp mồi biểu hiện P24Bam
69
và P24Xho cú gắn thờm trỡnh tự nhận biết của enzyme BamH I ở mồi xuụi và trỡnh tự nhận biết của Xho I ở mồi ngược.
P24Bam: 5’- TGGATCCCAAGGGCAAATGGTACATCAGC -3’ BamH I
P24Xho: 5’- TCTCGAGTGGATTCGCATTTTGGACTAGC -3’
Xho I
Sản phẩm PCR được tạo dũng vào vector tỏch dũng pCR2.1 (Invitrogen) và kiểm tra lại trỡnh tự (ABI 3100 Avant Genetic Analyzer).
Đoạn gen p24 được cắt ra khỏi vector tỏch dũng bằng 2 enzyme BamH I và
Xho I và gắn vào vector biểu hiện pET32a(+) đó xử lý bằng BamH I và Xho I.
Sản phẩm nối ghộp được biến nạp và tế bào E. coli chủng DH5α, sau đú chọn lọc dũng plasmid tỏi tổ hợp và cắt kiểm tra lại bằng enzyme BamH I và Xho I.
Vectơ tỏi tổ hợp rpET-p24 được biến nạp vào tế bào E.coli chủng BL21 (DE3), cấy trải trờn mụi trường LB cú bổ sung khỏng sinh ampicillin. Nhặt một khuẩn lạc riờng rẽ, nuụi trong mụi trường LB lỏng cú bổ sung ampicillin (100àg/ml) qua đờm, sau đú cấy chuyển 1% sang mụi trường mới, tiếp tục nuụi lắc ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6-1 thỡ cảm ứng bằng IPTG với nồng
độ cuối cựng là 1 mM, nhiệt độ 37oC trong thời gian 3 giờ trờn mỏy lắc tốc độ 200 vũng/phỳt sau cảm ứng với IPTG. Ly tõm thu tế bào và hũa tế bào lại
trong đệm phỏ tế bào. Tế bào sau đú được phỏ bằng siờu õm trong 10 phỳt. Ly tõm tỏch riờng pha nổi, pha cặn được hũa lại trong cựng thể tớch đệm phỏ tế bào ban đầu. Chạy điện di kiểm tra protein tỏi tổ hợp ở cả pha nổi và pha cặn trờn gel SDS-PAGE 12,5% để xỏc định trạng thỏi biểu hiện của protein tỏi tổ hợp.
Sau khi xỏc định được điều kiện biểu hiện, tiến hành nuụi cấy tế bào E.
coli lượng lớn hơn (50 ml mụi trường trong bỡnh tam giỏc 200 ml) để thu
nhận và tinh chế khỏng nguyờn tỏi tổ hợp. protein tỏi tổ hợp bằng cột sắc ký ỏi lực ProBond™ Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Sau khi tinh chế, protein
70
P24 tỏi tổ hợp được kiểm tra khả năng phản ứng của với khỏng thể khỏng
HIV tự nhiờn trong huyết thanh bệnh nhõn bằng kỹ thuật Western blot. Cỏc dũng tế bào E. coli cú khả năng tổng hợp protein P24 tỏi tổ hợp mạnh và phản
ứng đặc hiệu với khỏng thể khỏng HIV tự nhiờn trong huyết thanh bệnh nhõn được bổ sung glycerol vụ trựng tới nồng độ cuối cựng là 30% và bảo quản ở -
80oC.