- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.21.Phương phỏp chế tạo bộ kit ngưng kết hạt latex chẩn đoỏn H
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.21.Phương phỏp chế tạo bộ kit ngưng kết hạt latex chẩn đoỏn H
* Chuẩn bị khỏng nguyờn
a) Sau khi tinh chế cỏc protein tỏi tổ hợp GP120, GP41, P24 của HIV, kiểm tra cỏc phõn đoạn bằng điện di gel polyacrylamide.
b) Chọn cỏc phõn đoạn cú nồng độ protein cao nhất của mỗi protein
GP120, GP41, P24 để sản xuất kit ngưng kết hạt latex.
c) Định lượng protein tỏi tổ hợp trong cỏc phõn đoạn đó chọn bằng
phương phỏp Bradford, nồng độ tối thiểu phải đạt 0,5 mg/ml.
* Chuẩn bị hạt latex và sản xuất kit
Để cú thể gắn protein vào hạt latex, trước tiờn chỳng tụi phải hoạt hoỏ
cỏc nhúm carboxyl (COOH) trờn bề mặt hạt với carbodiimide (EDAC) hoà tan trong nước. Carbodiimide phản ứng với nhúm COOH để tạo ra một chất
trung gian (este hoạt động) và chất trung gian này sẽ tương tỏc với cỏc amine bậc 1 trong phõn tử protein đớch (hỡnh dưới).
Qui trỡnh gắn protein nghiờn cứu vào hạt carboxyl gồm cỏc bước sau: - Để hạt latex đó được carboxyl húa, coupling buffer và cỏc buffer rửa/bảo
quản (PolyLink Wash/Storage buffer) ở nhiệt độ phũng 10-20 phỳt trước khi tiến hành thớ nghiệm.
Hạt carboxyl EDAC Chất trung gian (este hoạt động)
72
- Hỳt huyền dịch hạt latex đó được carboxyl húa (COOH) 10% vào 3 ống
Eppendorf (đó được đỏnh dấu P24, GP41 và GP120), mỗi ống 120 àl (tương đương với 12,5 mg).
- Ly tõm 1000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt, loại bỏ dịch nổi. - Hoà cặn thu được ở bước 3 trong 0,4 ml PolyLink coupling buffer. - Ly tõm 1000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt, thu cặn.
- Hoà cặn lại trong 0,17 ml PolyLink coupling buffer.
- Trước khi sử dụng, chuẩn bị dung dịch EDAC (200 mg/ml) bằng cỏch hoà tan 20 mg PolyLink EDAC trong 100 àl PolyLink coupling buffer. Dựng
ngay sau khi chuẩn bị.
- Bổ sung 20 àl dung dịch EDAC vào mỗi ống Eppendorf chứa hạt latex đó được carboxyl húa (COOH) chuẩn bị ở trờn.
- Trộn đều bằng vortex nhẹ hoặc đảo ngược ống Eppendorf vài lần.
- Bổ sung 500 àg mỗi loại protein tỏi tổ hợp tinh sạch vào mỗi ống (P24,
GP41, GP120), đảo đều bằng tay hoặc vortex ngắn. - Lắc nhẹ 1 giờ ở nhiệt độ phũng.
- Ly tõm thu cặn 1000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt. Giữ dịch nổi để xỏc định lượng protein đó gắn.
- Hoà lại cặn trong 0,4 ml PolyLink Wash/Storage buffer.
- Lặp lại cỏc bước 12 và 13. Kết hợp dịch nổi thu được ở bước 12 và 13 để tớnh lượng protein đó gắn vào hạt.
- Kiểm tra khả năng phản ứng của hạt latex đó gắn khỏng nguyờn với khỏng thể khỏng HIV trong huyết thanh bệnh nhõn (Chỳ ý: khỏng thể khỏng P24 hỡnh thành sớm hơn so với khỏng thể khỏng GP41 và GP120, vỡ vậy chọn cỏc mẫu huyết thanh đó được kiểm tra trước bằng Dot blot).
- Sau khi kiểm tra, trộn huyền dịch hạt latex đó gắn khỏng nguyờn trong 3
ống vào 1 ống để được 1,2 ml huyền dịch latex phỏt hiện khỏng thể trong
73 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuyển sang lọ chuyờn dụng và bảo quản ở nhiệt độ 4-8oC.