- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.22.Phương phỏp chết ạo bộ kit ELISA chẩn đ oỏn H
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.22.Phương phỏp chết ạo bộ kit ELISA chẩn đ oỏn H
*Chuẩn bị khỏng nguyờn
Cỏc protein tỏi tổ hợp đó tinh chế GP120, GP41, P24 của HIV-1 được xỏc định nồng độ bằng phương phỏp Bradford. Sau khi xỏc định, mỗi loại protein được pha loóng trong dung dịch gắn bản để cú nồng độ 7,5 àg/ml. Trộn cả 3 loại khỏng nguyờn với nhau theo tỷ lệ 1 :1 :1 để cú khỏng nguyờn gắn bản. Như vậy trong mỗi ml dung dịch gắn bản sẽ cú 2,5 àg cho mỗi loại khỏng nguyờn.
*Gắn bản và tạo kit
1. Sau khi chuẩn bị, khỏng nguyờn sẽ được đưa vào phiến nhựa vi lượng 96 giếng đỏy bằng dựng cho ELISA (TiterTek, Mỹ), mỗi giếng 100 àl. Như vậy mỗi giếng của phiến nhựa vi lượng sẽ cú 250 ng khỏng nguyờn mỗi loại (250 ng GP120, 250 ng GP41 và 250 ng P24). Để khỏng nguyờn gắn bản trong tủ
lạnh 4oC qua đờm.
2. Loại bỏ dung dịch gắn bản, rửa bản 3 lần bằng dung dịch rửa bản.
3. Che chắn phần khụng gắn protein trong giếng bằng 200 àl dung dịch 5% sữa tỏch bơ pha trong dung dịch rửa bản. Để ở nhiệt độ phũng thớ nghiệm 1 giờ.
4. Loại bỏ dung dịch che chắn. Rửa bản 3 lần trong điều kiện ủ với đệm rửa bản, mỗi lần 5 phỳt ở nhiệt độ phũng.
5. Loại bỏ dung dịch rửa bản. Đậy nắp bản, cho bản vào tỳi nilon hàn kớn để
giữẩm.
6. Kiểm tra độ nhạy và độđặc hiệu của bộ kit.
7. Đúng hộp (1 bản/hộp) cựng với cỏc dung dịch và sinh phẩm cần thiết dựng cho ELISA.
74