- Kỹ thuật ELISA Sandwich
2.2.2.Phương phỏp thiết kế cỏc cặp mồi xỏc định phõn typ eB và CRF01_AE
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2.Phương phỏp thiết kế cỏc cặp mồi xỏc định phõn typ eB và CRF01_AE
CRF01_AE
Cỏc cặp mồi xỏc định phõn type B và CRF01_AE bằng Nested PCR
được thiết kế dựa trờn trỡnh tự gen p24 của phõn cỏc phõn type này lưu hành ở
cỏc khu vực khỏc nhau trờn thế giới.
Hai cặp mồi để xỏc định phõn type B bằng Nested PCR :
Cặp mồi vũng 1 Trỡnh tự mồi Tm (0C)
P24B1 5’- CCTATAGTGCAGAACCTTCAGGG-3’ 52
48
Cặp mồi vũng 2 Trỡnh tự mồi Tm (0C)
P24B3 5’- GGGCAAATGGTACATCAAGCC-3’ 49 P24B4 5’- GTAGCTGCTGGTCCCAATGC -3’ 51 P24B4 5’- GTAGCTGCTGGTCCCAATGC -3’ 51
Khuếch đại gen p24 phõn typ B bằng phương phỏp Nested PCR: * Phản ứng PCR vũng 1
+ Thành phần của phản ứng PCR vũng 1:
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O dein 17.1
Dung dịch đệm cho Taq DNA polymerase 2.5
DNA từ mẫu tỏch chiết 1
P24B1 1 P24B2 1 dNTP 2
Taq DNA polymerase 0.4
Tổng thể tớch 25
+ Chu trỡnh nhiệt:
Bước 1: 940C - 3 phỳt; Bước 2: 940C - 1 phỳt; Bước3: 450C -50 giõy; Bước 4: 720C - 1 phỳt 30 giõy; Bước 5: lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4: Bước 6: 720C - 8 phỳt; Bước 7: 40C - vụ cựng.
*Phản ứng PCR vũng 2.
+ Thành phần của phản ứng:
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O dein 17.1
Dung dịch đệm cho Taq DNA polymerase 2.5 Sản phẩm PCR vũng 1 1
49
P24B4 1 dNTP 2
Taq DNA polymerase 0.4
Tổng thể tớch 25
+ Chu trỡnh nhiệt: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 1: 940C – 3 phỳt; Bước 2: 940C – 1 phỳt; Bước3: 510C – 50 giõy. Bước 4: 720C – 1 phỳt 30 giõy; Bước 5: lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; Bước 6: 720C – 8 phỳt; Bước 7: 40C – vụ cựng.
Hai cặp mồi để xỏc định phõn type CRF01_AE bằng Nested PCR :
Cặp mồi vũng 1 Trỡnh tự mồi Tm (0C) P24E1 5’- AAACATTTAGTATGGGCAAGCAG-3’ 53,8 P24E2 5’-TGGCTAGGTCCTCCCACTCC-3’ 60,7 Cặp mồi vũng 2 Trỡnh tự mồi Tm (0C) P24E3 5’-CACAAGGGCAAATGGTACATCC-3’ 54,2 P24E4 5’-AAATGGACTTACAGTCTGGATTCG-3’ 54,8 * Phản ứng PCR vũng 1: Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl) H2O khử ion vụ trựng 16,1
Dung dịch đệm của Taq DNA polymerse 10X 2,5
dNTP 2,5 mM 2,0
P24E1 10 pmol/àl 1,0
P24E2 10 pmol/àl 1,0
Taq DNA polymerse 5U/àl 0,2
ADN khuụn 50~100 ng 2,0
50
Chu trỡnh nhiệt: 940C – 3 phỳt, 940C – 1 phỳt, 530C – 1 phỳt, 720C – 1 phỳt 20 giõy, 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phỳt, kết thỳc ở 40C.
Theo lý thuyết, sản phẩm PCR vũng 1 cú độ dài 980 bp.
* Phản ứng PCR vũng 2:
Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
H2O khử ion vụ trựng 16,1
Dung dịch đệm của Taq DNA polymerse 10X 2,5
dNTP 2,5 mM 2
P24E3 10 pmol/àl 1
P24E4 10 pmol/àl 1
Taq DNA polymerse 5U/àl 0,2
Sản phẩm PCR vũng 1 2
Tổng thể tớch 25
Chu trỡnh nhiệt: 940C – 3 phỳt, 940C – 1 phỳt, 530C – 1 phỳt, 720C – 1 phỳt 30 giõy, 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phỳt, kết thỳc ở 40C. Sản phẩm PCR vũng 2 cú độ dài theo lý thuyết là 588 bp, được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1% và bảo quản ở -200C.