- Kỹ thuật ELISA Sandwich
3.4.1.Thiết kế vector biểu hiện repET-gp
KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
3.4.1.Thiết kế vector biểu hiện repET-gp
Vựng ngoại bào gen mó húa protein GP120 được khuếch đại từ vector pCR2.1 mang gen gp120 do chỳng tụi tỏch dũng trước đõy. Bằng phương
phỏp PCR sử dụng cặp mồi biểu hiện GP120FQ và GP120RQ. Sử dụng chương trỡnh dự đoỏn vị trớ glycosyl húa NetOGlyc-3.1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/), chỳng tụi nhận thấy đõy là vựng cú nhiều vị trớ acid amin được glycosyl húa. Hay núi cỏch khỏc đõy là vựng mang cỏc quyết định khỏng nguyờn của protein GP120. Li và cs (2009) đó
chứng minh được rằng, quỏ trỡnh glycosyl húa GP120 khụng chỉ giỳp GP120 tạo cấu trỳc hoàn chỉnh mà cũn ảnh hưởng rất lớn đến đỏp ứng miễn dịch đối
88
với khỏng nguyờn này. Kết quả điện di gel agarose 1% cho thấy sản phẩm
PCR được nhõn lờn rất đặc hiệu, kớch thước phõn tử khoảng 530 bp phự hợp với tớnh toỏn lý thuyết (537 bp) (hỡnh 3.9.A). Sản phẩm PCR được tinh sạch, gắn vào vector pCR2.1 và xỏc định trỡnh tự. Kết quả cho thấy trỡnh tự gen
gp120 khụng bị sai lệch so với trỡnh tự gốc và dịch mó thụng suốt, khụng tạo
mó kết thỳc trong gen. Sau đú, gen gp120 được cắt ra khỏi vector tỏch dũng bằng hai enzyme BamH I và Xho I và gắn vào vector biểu hiện pET32a(+) tại vị trớ 2 enzyme tương ứng để tạo thành vector tỏi tổ hợp repET-gp120. Cỏc
dũng plasmid tỏi tổ hợp mang gen gp120 (repET-gp120) được chọn lọc bằng cắt kiểm tra bằng BamH I và Xho I, sau đú chạy điện di trờn gel agarose để
phõn tớch kết quả. Kết quả (hỡnh 3.9.B) cho thấy, cỏc dũng plasmid ở đường chạy số 2,3,5 và 6 mang gen gp120. Plasmid tỏi tổ hợp này sau đú được biến nạp vào tế bào E. coli chủng BL21 Star™ (DE3) để biểu hiện gen.
Hỡnh 3.9. Chọn lọc cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp pET32a(+) mang gen gp120
bằng điện di trờn gel agarose 1%. A. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen
gp120 bằng cặp mồi GP120FQ và GP120RQ. 1: thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), 2: sản phẩm PCR (gp120); B. Cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp (repET-gp120) kiểm tra bằng enzyme cắt hạn chế. 1: thang DNA chuẩn 1 kb, 2-6: cỏc dũng plasmid từ số 1-5 cắt bằng BamH I và Xho I, 7: đối chứng (đoạn gen gp120). 1 2 500 bp ~ 537 bp 750 bp A 1 2 3 4 5 6 7 ~ 537 bp B
89