- Kỹ thuật ELISA Sandwich
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.16. Phương phỏp thiết kế vector biểu hiện gen mó hoỏ khỏng nguyờn gp120 của phõn type CRF01_AE
gp120 của phõn type CRF01_AE
Plasmid chứa gen mó húa protein vỏ GP120 đó tạo dũng được sử dụng làm khuụn để khuếch đại vựng ngoại bào gen mó húa protein GP120 bằng cặp mồi biểu hiện GP120FQ và GP120RQ cú gắn thờm trỡnh tự nhận biết của enzyme BamH I ở mồi xuụi và trỡnh tự nhận biết của Xho I ở mồi ngược. GP120FQ: 5’- TACTGCGGATCCGTTCCTGCGTGGAGAGATG-3’
GP120RQ: 5’–AGTACTCTC GAGTTAGGTTACCTTTGGGCAAG-3’
Sản phẩm PCR được tạo dũng vào vector tỏch dũng pCR2.1 (Invitrogen) và kiểm tra lại trỡnh tự (ABI 3100 Avant Genetic Analyzer).
Xho I BamH I
65
Đoạn gen gp120 được cắt ra khỏi vector tỏch dũng bằng 2 enzyme BamH I
và Xho I và gắn vào vector biểu hiện pET32a(+) đó xử lý bằng BamH I và Xho I. Sản phẩm nối ghộp được biến nạp và tế bào E. coli chủng DH5α, sau
đú chọn lọc dũng plasmid tỏi tổ hợp và cắt kiểm tra lại bằng enzyme BamH I
và Xho I.
Vector pET32a(+) tỏi tổ hợp mang đoạn gen gp120 được biến nạp vào tế bào E. coli chủng BL21 Star™ (DE3). Protein tỏi tổ hợp được biểu hiện
trong mụi trường LB lỏng cú bổ sung Ampicilin và cảm ứng bằng IPTG với
nồng độ cuối cựng là 1mM. Protein tỏi tổ hợp được thu nhận sau 3 giờ nuụi
cấy cảm ứng ở 370C và kiểm tra bằng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide (Laemmli, 1970).
Sau khi xỏc định được điều kiện biểu hiện, tiến hành nuụi cấy tế bào E.
coli lượng lớn hơn (50 ml mụi trường trong bỡnh tam giỏc 200 ml) để thu
nhận và tinh chế khỏng nguyờn tỏi tổ hợp. protein tỏi tổ hợp bằng cột sắc ký ỏi lực ProBond™ Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Sau khi tinh chế, protein GP120 tỏi tổ hợp được kiểm tra khả năng phản ứng của với khỏng thể khỏng HIV tự nhiờn trong huyết thanh bệnh nhõn bằng kỹ thuật Western blot. Cỏc dũng tế bào E. coli cú khả năng tổng hợp protein GP120 tỏi tổ hợp mạnh và phản ứng đặc hiệu với khỏng thể khỏng HIV tự nhiờn trong huyết thanh bệnh nhõn được bổ sung glycerol vụ trựng tới nồng độ cuối cựng là 30% và bảo
quản ở -80oC.