- Kỹ thuật ELISA Sandwich
KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
3.5.2. Tối ưu húa điều kiện biểu hiện và xỏc định trạng thỏi GP41 tỏi tổ hợp
Hỡnh 3.13. Chọn lọc cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp pET32a(+) mang gen gp41
bằng điện di trờn gel agarose 1%. A. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen
gp41 bằng cặp mồi GP41K1 và GP41K2. M: thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), 1: sản phẩm PCR (gp41); B. Cỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp (repET-gp41) cắt kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn. M: thang DNA chuẩn 1 kb, 1-6: cỏc dũng plasmid từ số 1-6 cắt bằng BamH I và Xho I.
3.5.2. Tối ưu húa điều kiện biểu hiện và xỏc định trạng thỏi GP41 tỏi tổ hợp hợp
Cú rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thỏi biểu hiện của protein tỏi tổ hợp trong cỏc hệ thống biểu hiện tỏi tổ hợp. Đối với hệ thống biểu hiện trong vi khuẩn E.coli, nhiệt độ nuụi cấy, nồng độ chất cảm ứng
IPTG là 2 trong những yếu tố tỏc động nhiều nhất đến sự biểu hiện của
protein tỏi tổ hợp. Vỡ vậy, trước khi biểu hiện lượng lớn, chỳng tụi tiến hành thăm dũ tỡm nhiệt độ biểu hiện và nồng độ IPTG thớch hợp. IPTG được khảo
sỏt ở 3 nồng độ khỏc nhau là 0,1, 0,25 và 1 mM. Kết quả (hỡnh 3.14.A) cho thấy, sau khi cảm ứng bằng IPTG suất hiện một băng protein cú kớch thước
khoảng 37 kDa, đỳng với kớch thước dự đoỏn của GP41 tỏi tổ hợp dạng dung
500bp M 1 A 1 2 3 4 5 6 M 500bp B
94
hợp (phần phục lục). Kết quả này cũng cho thấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG
ảnh hưởng đỏng kể đến mức độ biểu hiện của protein tỏi tổ hơp, và tối ưu nhất ở nồng độ 1 mM.
Tiếp theo, chỳng tụi khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ và
trạng thỏi biểu hiện của protein tỏi tổ hợp. Kết quả chạy điện di kiểm tra trờn gel polyacrylamide (hỡnh 3.14.B) cho thấy, ở nhiệt độ 30oC, 80% protein tỏi tổ hợp được biểu hiện ở dạng hũa tan. Trong khi đú khi tăng nhiệt độ biểu
hiện lờn 37oC, kết quả hoàn toàn ngược lại, hơn 90% protein tỏi tổ hợp biểu hiện ra ở dạng thể vựi (hỡnh 3.14.B). Như vậy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến trạng thỏi biểu hiện của protein tỏi tổ hợp. Kết quả này cú thể được giải thớch như sau, ở nhiệt độ 37oC vi khuẩn sinh trưởng rất mạnh do đú protein được tổng hợp nhanh trong hệ thống tế bào vật chủ và khụng được gấp nếp (folding) để tạo thành protein cú cấu đỳng với cấu trỳc tự nhiờn, dẫn đến cỏc protein biểu hiện ra sẽ tập trung lại thành dạng thể vựi (inclusion body). Từ kết quả này chỳng tụi đó chọn điều kiện biểu hiện GP41 ở 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 1 mM.
Hỡnh 3.14. Kết quả điện di trờn gel SDS-PAGE. A. Kết quả tối ưu húa điều
kiện biểu hiện: M. thang chuẩn protein, giếng số 1: mẫu trước khi cảm ứng
IPTG, giếng số 2, 3, 4 là mẫu sau cảm ứng IPTG ở cỏc nồng độ tướng ứng là
M 1 2 3 4 35 35 62,5 25 45 kDa GP41 35- 25- 45- 62,5- kDa M 1 2 3 4 5 GP41 A B
95
0,1, 0,25 và 1 mM. B. Kiểm tra trạng thỏi tồn tại của protein tỏi tổ hợp. M: thang protein chuẩn, 1: mẫu trước cảm ứng IPTG, 2: mẫu sau cảm ứng IPTG
ở pha cặn tại 30oC, 3: mẫu sau cảm ứng IPTG ở pha nổi tại 30oC. 4: mẫu sau cảm ứng IPTG ở pha cặn tại 37oC, 5: mẫu sau cảm ứng IPTG ở pha nổi tại
37oC. Mũi tờn chỉ băng GP41 tỏi tổ hợp.