CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4.1. Xét nghiệm chẩn đoán Streptococcus pneumoniae
Chẩn đốn phịng thí nghiệm là vấn đề cốt lõi của các nghiên cứu căn nguyên gây viêm phổi. Với những tiến bộ gần đây đã đưa ra nhiều phương pháp chẩn đoán mới giúp cải thiện đáng kể khả năng xác định tác nhân gây bệnh đường hô hấp. Tuy nhiên việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi vẫn còn là một thách thức, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Điều này chủ yếu là do sử dụng các kỹ thuật không phù hợp trong các nghiên cứu, khó khăn trong thu thập mẫu bệnh phẩm và phân tích, biện giải kết quả. Các phương pháp chẩn đốn thường quy phịng thí nghiệm được sử dụng trong nhiều thập kỷ qua là: soi kính, ni cấy phân lập bệnh phẩm đường hô hấp, cấy máu, phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu trong máu hoặc phát hiện axid nucleic (kỹ thuật PCR) trong điều kiện phịng thí nghiệm tiêu chuẩn [107].
1.4.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy, định danh
Kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy đờm, bệnh phẩm đường hô hấp dưới (dịch rửa phế quản) và cấy máu trước đây là kỹ thuật chủ yếu để chẩn đoán căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi. Định danh tác nhân đường hô hấp từ các mẫu bệnh phẩm lấy trực tiếp tại vị trí nhiễm khuẩn hoặc từ vị trí vơ trùng khác (như máu) cung cấp bằng chứng chính xác về các vi sinh vật gây bệnh, đây là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đốn tác nhân vi khuẩn gây bệnh.
Q trình lấy mẫu ảnh hưởng lớn tới soi kính, ni cấy và phân tích kết quả. Bệnh phẩm đường hơ hấp dưới có thể lẫn với các chất tiết đường hô hấp trên đặc biệt đối với bệnh phẩm là đờm, dẫn đến kết quả sai. Do vậy mẫu đờm phải được kiểm tra chất lượng trước khi xử lý mẫu để khẳng định chắc chắn mẫu được lấy từ đường hơ hấp dưới. Q trình kiểm tra này được đánh giá thông qua số lượng tế bào biểu mô vảy và tế bào bạch cầu đa nhân trong tiêu bản nhuộm Gram. Sự có mặt của dưới 10 tế bào biểu mô vảy và trên 25 tế bào bạch cầu đa nhân trên một vi trường ở độ phóng đại 3100 được xem là mẫu bệnh phẩm của đường hô hấp dưới ở người lớn [108]. Nhuộm Gram trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và có thể đó chỉ là vi khuẩn chí (sống hội sinh), ngoại trừ các tiêu bản của các bệnh phẩm máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể có bản chất là vô trùng. Những tiêu bản đờm có giá trị xác định căn nguyên phế cầu chỉ khi số lượng bạch cầu đa nhân tăng lên và thấy có vi khuẩn phế cầu (hình lưỡi mác hay ngọn nến thường nối đơi, cũng có thể đứng đơn lẻ, bắt màu Gram dương) ở bên trong hoặc cả bên ngoài tế bào bạch cầu và kết hợp với số lượng vi khuẩn khi cấy đếm bệnh phẩm đường hơ hấp thì có thể định hướng chẩn đoán phế cầu là tác nhân gây viêm đường hô hấp. Bệnh phẩm đường hô hấp dưới thường được cấy trên môi trường thạch máu, chocolate và MacConkey sẽ phân lập được hầu hết các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi.
Cấy máu là kỹ thuật chẩn đoán quan trọng đối với bệnh viêm phổi, nhưng chỉ ở số ít bệnh nhân viêm phổi ghi nhận nhiễm trùng máu. Tỉ lệ nhiễm trùng máu là 7%-13% người lớn [145] và 1%-5% trẻ em [89] trong số bệnh nhân nhập viện do viêm phổi cộng đồng, tỷ lệ này cao hơn trong trường hợp bệnh nặng.
Các môi trường nuôi cấy phân lập phế cầu được ủ ấm trong khí trường 37oC, 5% CO2 từ 16 - 24 giờ. Quan sát trên môi trường thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn có vỏ trịn, dẹt, nhỏ (0,5 - 1,5 mm), khơng màu, có xu hướng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh ve (kiểu tan huyết alpha). Sau đó làm thêm các thử nghiệm khẳng định (thử nghiệm optochin và tan trong muối mật). Phế cầu khuẩn nhạy cảm optochin (đường kính vịng vơ khuẩn ≥ 14 mm) hoặc ít nhạy cảm với optochin (đường kính vịng vơ khuẩn từ 9 - 13 mm) nhưng tan trong muối mật.
1.4.1.2. Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán S. pneumoniae
Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán S. pneumoniae (Xét nghiệm phát hiện axit
nucleic, như PCR) có nhiều ưu điểm trong chẩn đốn căn ngun nhiễm trùng đường hơ hấp trong phịng xét nghiệm. Để định danh S. pneumoniae bằng PCR, một số gen
đích được sử dụng như autolysin (lytA), pneumolysin (ply), gen adhesin A bề mặt phế cầu (pcsA) và một gen cho protein giả định Spn9802. Tuy nhiên trong số đó, lytA là gen đích có độ nhạy cao nhất và có khả năng phân biệt S. pneumoniae với S. pseudopneumoniae, nên primer lytA thường được sử dụng kết hợp với các cặp mồi đặc hiệu typ huyết thanh
khác khi thử nghiệm trên các mẫu lâm sàng để khẳng định chủng S. pneumoniae cho kỹ
thuật này. Bên cạnh đó primer lytA cịn có vai trị định lượng vi khuẩn S. pneumoniae
tổng số, bao gồm cả những chủng không định typ huyết thanh trong kỹ thuật [107].
1.4.1.3. Kỹ thuật xét nghiệm kháng nguyên, kháng thể
Nguyên lý kỹ thuật: Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme, trong đó
kháng nguyên hoặc kháng thể hồ tan được gắn vào một polime khơng tan (phiến nhựa - pha rắn) nhưng vẫn giữ được hoạt tính của yếu tố miễn dịch. Pha rắn - tách các yếu tố liên kết miễn dịch khỏi các yếu tố không miễn dịch. Trong kỹ thuật ELISA, các kháng thể đánh dấu enzyme và kháng nguyên trở thành không tan do bị gắn vào pha rắn. Để phát hiện phức hợp kháng nguyên – kháng thể có gắn enzyme dùng hệ cơ chất thích ứng với enzyme như: Cơ chất O-Phenylen Diamin (OPD) với enzyme horseradish peroxydase (HRPO); cơ chất tetra- methylbenzidin (TMB)... Khi phản ứng enzyme cơ chất xảy ra, sẽ tạo sự chuyển màu, dựa vào mức độ chuyển màu (mật độ quang học) của mẫu xét nghiệm
để đánh giá sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể bằng máy đo mật độ quang (máy đọc ELISA) hoặc có thể đọc kết quả bằng mắt.
Đối với ELISA hiện đang sử dụng, kháng huyết thanh được hấp phụ bằng CWPS và CPS vỏ typ 22F của phế cầu [31]. CWPS là một kháng nguyên có mặt ở tất cả các typ huyết thanh của phế cầu khuẩn. Do vậy kháng nguyên CWPS được sử dụng làm yếu tố phủ bản trong quá trình sản xuất các kit sinh phẩm chẩn đoán phế cầu khuẩn bằng kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA). Lý do typ 22F được chọn là vì vỏ polysaccharide là sẵn có và khơng bao gồm trong bất kỳ vắc xin cộng hợp (PCV) nào dự kiến trong tương lai. Sau khi nhận thấy đầu hoạt tính của CPS typ 22F là một biến thể CWPS, thì một sản phẩm hấp thụ mới CWPS đa giá đã được hãng SSI Diagnostica đưa ra, làm cho bước tiền hấp phụ trở nên dễ dàng hơn [143]. Ngày nay, SSI Diagnostica đã có 92 typ huyết thanh CPS trong các lọ 10 mg đông khô, cũng như các typ CWPS đơn giá và đa giá.
1.4.1.4. Lựa chọn kỹ thuật cho nghiên cứu chẩn đoán xác định
Trong luận án này, với mục đính chẩn đốn bệnh và thu thập chủng vi khuẩn cho nghiên cứu định typ huyết thanh và xác định tính kháng kháng sinh, nên chúng tơi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập vừa để chẩn đoán bệnh, vừa để thu thập chủng vi khuẩn cho nghiên cứu. Ngày nay nuôi cấy phân lập vẫn là tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán nhiễm khuẩn. Kỹ thuật PCR có độ nhạy cao có thể phát hiện axit nucleic ở nồng độ thấp ngay cả khi vi khuẩn đích đã chết, thời gian trả kết quả nhanh, ít bị ảnh hưởng bởi việc bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó so với phương pháp ni cấy và ngồi ra có thể cung cấp thông tin bổ sung như sự hiện diện của gen kháng kháng sinh [105]. Tuy nhiên thông thường chỉ sử dụng để phát hiện trực tiếp trình tự gen đặc hiệu của vi khuẩn trong dịch não tủy bằng các phản ứng PCR đơn mồi (chỉ phát hiện phế cầu) và PCR đa mồi (phát hiện phế cầu và nhiều loại vi khuẩn khác) với các đoạn mồi đặc hiệu được biết trước. Trong nghiên cứu của chúng tơi, kỹ thuật PCR khơng áp dụng cho chẩn đốn bệnh giai đoạn ban đầu mà được sử dụng cho giai đoạn sau khi đã có chủng được định danh là phế cầu khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy để khẳng định lại vi khuẩn, chúng tôi sử dụng gen đích đặc hiệu để khẳng định thêm về mặt sinh học phân tử.
Xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên vỏ phế cầu hỗ trợ đánh giá hiệu quả các thử nghiệm vắc xin, hoặc dự kiến thời gian tiêm mũi nhắc lại. Một số nghiên cứu cho rằng vắc xin PCV23 không tạo được tế bào ghi nhớ miễn dịch và hiệu giá kháng thể mất dần theo thời gian [86]. Kết quả xét nghiệm ELISA cho thấy có mối tương quan yếu giữa nồng độ kháng thể và hiệu quả của vắc xin. Do vậy kỹ thuật ELISA được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn để ước tính nồng độ kháng thể, nên không được áp dụng trong nghiên cứu này.