CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8.5. Kỹ thuật PCR phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh
a/ Thông tin về mồi
Bảng 2.8. Thông tin về mồi phát hiện các kiểu gen kháng kháng sinh của S. pneumoniae [110]
Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích
thước Gen mã hóa
PCR 1
1 lytA-681F CAA CCG TAC AGA ATG AAG CGG
319bp Autolysine
lytA-999R TTA TTC GTG CAA TAC TCG TGC G 2 Pbp1A-2037F AAA CCG CGA CTG GGG ATC AAC
238 bp
Penicillin binding protein 1A
Pbp1A-2275R GGT TGA GCT CGA CCT TGT TT 3 Pbp2X-1255F CCA GGT TCC ACT ATG AAA GTG
197bp
Penicillin binding protein 2X
Pbp2X-1451R ATC CCA ACG TTA CTT GCG TGT 4 Pbp2B-1566F CCT ATA TGG TCC AAA CAG CCT
147 bp Penicillin binding protein 2B Pbp2B-1693R GGT CAA TTC CTG TCG CAG TA PCR 2
4 MefA-180F CTG TAT GGA GCT ACC TGT CTG G
293 bp MefA MefA-180F CCC AGC TTA GGT ATA CGT AC
5 ErmB-721F CGT ACC TTG GAT ATT CAC CG
224 bp ErmB ErmB-944R GTA AAC AGT TGA CGA TAT TCT CG
b/ Áp dụng và tối ưu hoá quy trình
Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae (chủ yếu là β-
lactam và macrolide) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối với các protein gắn penicillin (chủ yếu là pbp1a, pbp2x, pbp2b) hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích
(methyl hóa ribosom) do gen ermB (gây kháng đồng thời nhiều dòng kháng sinh của
macrolides, clindamycine và tetracycline) hoặc hoặc hình thành các bơm sinh học nằm ngang với màng tế bào vi khuẩn giúp đẩy kháng sinh nhóm macrolide ra ngồi ngay khi kháng sinh vừa xâm nhập, được quy định thông tin di truyền bởi gen nhảy mefA [21].
Nghiên cứu áp dụng quy trình của Nagai và cộng sự năm 2001. Tuy nhiên có cải tiến về việc kết hợp các mồi cho phản ứng. Quy trình của Nagai bao gồm 3 phản ứng với 6 cặp mồi: phản ứng PCR1 (lytA và pbp1A), phản ứng PCR2 (pbp2X và pbp2B) và phản
ứng PCR3 (mefA và ermB) [110]. Dựa trên kích thước và nhiệt độ gắn mồi, chúng tơi đã kết hợp phản ứng 1 và 2 lại thành 1 phản ứng. Các nhóm phản ứng được thể hiện trong Bảng 2.9. Quy trình sau khi được tối ưu trên các chủng chứng dương được thực hiện trên các chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm.
Bảng 2.9. Bảng so sánh tối ưu hố nhóm phản ứng PCR xác định gen kháng kháng sinh [110]
Nhóm phản ứng PCR
Quy trình trong nghiên cứu của Nagai Quy trình được tối ưu hố
1 lytA pbp1A 319bp 238 bp lytA pbp1A pbp2X pbp2B 319bp 238 bp 2 pbp2X pbp2B 197bp 147 bp 197bp 147 bp 3 mefA ermB 293 bp 224 bp mefA ermB 293 bp 224 bp
c/ Các bước tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh
Hai nhóm phản ứng PCR 1 và PCR 2 được tối ưu hóa về nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+, và điều kiện phản ứng chung cho cả hai nhóm để đạt được sự biểu hiện đồng thời của tất cả các gen kháng thuốc đích có trong mẫu chứng dương hỗn hợp được tách chiết từ chủng chuẩn do CDC cung cấp. Phản ứng PCR đa mồi phát hiện gen kháng thuốc của các chủng phế cầu được tiến hành sau khi thu được kết quả tối ưu hóa. PCR 1 bao gồm 4 cặp mồi lytA, pbp1A, pbp2X và pbp2B. PCR 2 bao gồm 2 cặp mồi
ermB và mefA theo Bảng 2.9.
Pha hỗn hợp phản ứng PCR: Sử dụng bộ sinh phẩm PCR của hãng Promega (Mỹ),
25µl hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 1X PCR buffer, 0,4µM mồi xi, 0,4µM mồi ngược, 2mM MgCl2, 200µM dNTP, Taq polymerase 1U. PCR1 gồm 4 cặp mồi lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B; PCR2 gồm 2 cặp mồi mefA và ermB. Chu trình nhiệt: 940C-5 phút, 35 chu kỳ (940C-30 giây, 530C-30 giây, 720C-40 giây), 720C-5 phút.
Đọc kết quả: Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR. Điện di trên gel agarose
2%, dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm bằng RedSafeTM trong môi trường đệm 1X TAE, 100V, thời gian 45 phút và chụp ảnh bằng máy chụp gel UVP BioDoc-ItTM Imaging System.