M PC 6 19F 23F 11 NT 19F 23F 14 NT NT 6 23F 6A/B 6A/B (-)
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chúng âm
M PC NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT (-) 18 NT
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chứng âm
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chứng âm
Độ nhạy: Mục tiêu của nghiên cứu là xác định các typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn S. pneumoniae nhằm cung cấp số liệu dịch tễ học typ huyết thanh của phế cầu
khuẩn, từ đó đưa ra chiến lược dự phịng vắc xin thích hợp cho nhóm trẻ dưới 5 tuổi tại Việt Nam. Do vậy chúng tôi tiến hành kỹ thuật trên các chủng đã phân lập từ bệnh phẩm. Với việc tách chiết ADN cho phản ứng PCR từ chủng vi khuẩn thì nồng độ ADN tách chiết lớn, việc xác định độ nhạy của kỹ thuật không cấp thiết trong nghiên cứu này.
3.2.2. Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định gen kháng kháng sinh
Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae (chủ yếu là β-
lactam và macrolide) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối với các protein gắn penicillin (pbp1A, pbp2X, pbp2B) hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích (methyl hóa
ribosom) do gen ermB (gây kháng đồng thời nhiều dòng kháng sinh của macrolides,
clindamycine và tetracycline) hoặc hình thành các bơm sinh học giúp đẩy kháng sinh ra ngoài ngay khi kháng sinh vừa xâm nhập do các gen mefA, mefE.
Nghiên cứu áp dụng quy trình của Nagai và cộng sự năm 2001. Tuy nhiên chúng tơi có cải tiến về việc kết hợp các mồi cho phản ứng. Quy trình của Nagai bao gồm 3 phản ứng với 6 cặp mồi: phản ứng PCR1 (lytA và pbp1A), phản ứng PCR2 (pbp2X và pbp2B)
và phản ứng PCR3 (mefA và ermB) [110]. Nghiên cứu đã xây dựng được kỹ thuật PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh với 2 phản ứng PCR. Phản ứng 1 sử dụng 4 cặp mồi của các gen lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B (kích thước tương ứng: 319 bp, 238 bp, 197bp
và 147 bp) phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và gen đặc hiệu cho phế cầu khuẩn lytA làm mẫu nội chứng. Phản ứng 2 sử dụng 2 cặp mồi là mefA và ermB (kích thước tương ứng là 293 bp và 224 bp). Sự kết hợp này đã giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và công sức 1/3 lần so với quy trình ban đầu. Hình ảnh điện di sản phẩm của quy trình sau đây:
M: Marker, 1-4 và 6-7: đơn mồi, 5: lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B, 8: mefA, ermB, (-): chứng âm.