CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4.3. Kỹ thuật xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn S.pneumoniae
1.4.3.1. Kỹ thuật PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh
S. pneumoniae kháng kháng sinh lần đầu tiên xuất hiện từ những thập niên 70, sau
đó gia tăng nhanh chóng trên tồn cầu. Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của
S. pneumoniae (chủ yếu là β-lactams và macrolide) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ
đối với các protein gắn penicillin (chủ yếu là PBP1A, PBP2X, PBP2B) [120] hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích (methyl hóa ribosom) do gen ermB (gây kháng đồng thời
nhiều dòng kháng sinh của macrolide, clindamycine và tetracycline) hoặc hình thành các bơm sinh học hoặc gây thay đổi tính thấm của kháng sinh do các gen mefA, mefE [21]. Vi khuẩn kháng thuốc thường lan truyền trong cộng đồng qua việc trao đổi các kiểu gen gây
kháng thuốc giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài. Hiện nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu để xác định nguồn gốc lan truyền các vi khuẩn kháng thuốc và các đột biến mới liên quan đến kháng thuốc. Phân tích đặc tính sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. pneumoniae lưu hành là nền tảng cho việc lựa chọn phác
đồ điều trị kháng sinh thích hợp.
1.4.3.2. Kỹ thuật xác định kiểu hình kháng kháng sinh
Các kỹ thuật xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các loại kháng sinh khác nhau được sử dụng hiện nay: kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy, kỹ thuật nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (MIC) và kỹ thuật sử dụng.
Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy: Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy, sẽ khuếch tán trong thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch, tạo thành các vịng ức chế. Dựa vào đường kính vịng ức chế và bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh khác nhau trong bảng CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Có ba mức độ nhạy cảm được qui định : nhạy cảm, kháng trung gian hoặc kháng hoàn toàn.
Kỹ thuật nồng độ ức chế tối thiểu MIC: Nồng độ kháng sinh bột được pha tăng
dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và có thể quan sát được bằng mắt thường. Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ giới hạn trong bảng CLSI.
Kỹ thuật sử dụng băng giấy Etest: là một kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối
thiểu ức chế vi khuẩn (MIC), dựa trên một băng giấy mỏng (5x50mm) đã tẩm kháng sinh với 20 nồng độ khác nhau được pha theo cấp số nhân (từ 0,016 đến 256 mg/l hoặc 0,002 đến 32mg/l tùy loại kháng sinh), đặt trên bề mặt đĩa thạch đã láng một lớp huyền dịch vi khuẩn. Sau một thời gian đủ cho vi khuẩn phát triển (18-24h), trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện vòng ức chế vi khuẩn theo hình elip, tùy thuộc vào mức độ nhạy cảm của vi khuẩn,
vòng ức chế vi khuẩn cắt vào băng giấy ở vị trí nào, đó sẽ là điểm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn.
1.4.3.3. Lựa chọn kỹ thuật xác định tính kháng kháng sinh
Sự xuất hiện các chủng S. pneumoniae kháng kháng sinh ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và sức khỏe người bệnh. Việc lựa chọn kháng sinh phụ thuộc vào hai yếu tố người bệnh và tác nhân gây bệnh. Chính sách kê đơn kháng sinh nhằm giảm tỷ lệ phát sinh vi khuẩn kháng thuốc và đảm bảo tính kinh tế trong điều trị. Bên cạnh đó việc kê đơn khơng đủ liều cũng sẽ dẫn đến thất bại điều trị và làm gia tăng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc [2]. Kỹ thuật ức chế nồng độ tối thiểu (MIC) nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Bên cạnh xác định được tỷ lệ các chủng vi khuẩn nhạy cảm và kháng kháng sinh, còn xác định được nồng độ tối thiểu cần thiết để tiêu diệt vi khuẩn, từ đó làm cơ sở để lựa chọn các mức liều trong điều trị. Do vậy kỹ thuật MIC được chúng tôi lựa chọn cho nghiên cứu này. Etest là một kỹ thuật phối hợp của hai kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch và kỹ thuật pha loãng kháng sinh trong thạch (MIC). Kỹ thuật này bộc lộ rõ sự ưu việt trong việc đáp ứng nhanh nhu cầu cấp thiết của công tác điều trị so với các kỹ thuật MIC trong canh thang hoặc trong thạch. Etest cho kết quả nhanh, rất dễ thực hiện. Đặc biệt thuận lợi cho việc xác định nồng độ MIC của những vi khuẩn khó bảo quản và đòi hỏi nhiều yếu tố trong môi trường phát triển như: H. influenzae, S. pneumoniae, Campylobacter… Tuy nhiên do chi phí cao nên chỉ được sử
dụng trong điều trị, không khả thi cho các nghiên cứu dịch tễ với số lượng lớn và cần lựa chọn loại kháng sinh theo mục đích nghiên cứu.