CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8.1. Kỹ thuật định danh lại vi khuẩn bằng nuôi cấy phân lập
a/ Phương pháp thu thập, bảo quản và vận chuyển chủng vi khuẩn
Bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính, nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ được phân lập và định danh theo thường qui xét nghiệm của các bệnh viện. Vi khuẩn S. pneumoniae đã định danh được bảo quản ở tủ âm sâu -80oC trong môi trường giữ chủng gồm canh thang BHI và 20% glycerol, vận chuyển về Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bằng dây chuyền lạnh không tan đông, sử dụng đá khô. Bảo quản ở tủ âm sâu nhiệt độ -80oC cho đến khi được khôi phục và định danh lại.
b/ Nuôi cấy chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae [5, 26]
- Môi trường và sinh phẩm: Thạch máu 5% (cừu hoặc thỏ), canh thang giàu dinh dưỡng (canh thang trypticasein soy hoặc brain-heart infusion (BHI) có 5% máu cừu. Khoanh giấy optochin (ethylhydrocuprein), bột muối mật (deoxycholate), nước muối sinh lý (NaCl 0,9%).
- Chủng vi khuẩn lưu tại tủ âm sâu của phịng thí nghiệm được cấy tăng sinh trên canh thang trypticasein soy, sau đó ria cấy trên mơi trường thạch máu 5% để thu được khuẩn lạc thuần.
- Điều kiện nuôi cấy: Các môi trường nuôi cấy phân lập phế cầu được ủ ấm trong
khí trường 37oC, 5% CO2 từ 16 - 24 giờ.
- Quan sát khuẩn lạc: Sau 16 - 24 giờ, các khuẩn lạc của phế cầu có vỏ trịn, dẹt,
nhỏ (0,5 - 1,5 mm), không màu, có xu hướng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Lấy một khuẩn lạc cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ 370C, 5% CO2 trong 16 giờ để làm thêm các thử nghiệm xác định.
K. pneumoniae, tan huyết
gamma
S. pneumoniae, tan huyết alpha S. aureus, tan huyết beta
Hình 2.3. Khuẩn lạc một số vi khuẩn trên môi trường thạch máu [26]
c/ Các thử nghiệm xác định S. pneumoniae
Thử nghiệm Optochin: Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin đường kính 6 mm (chứa 5μg chất ethylhydrocuprein), ủ 35 - 37oC và 5% CO2. Quan sát sau 16 - 24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy khơng có vịng vơ khuẩn có nghĩa đó chỉ là Viridans streptococci, nếu có
vịng vơ khuẩn có đường kính ≥ 14 mm là phế cầu, nếu vịng vơ khuẩn từ 9 - 13 mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility): Từ nuôi cấy thuần và mới (16
- 24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục >0,5 Mc Farland. Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25 ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25 ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25 ml muối mật 10% (deoxycholat), lắc nhẹ, ủ 35 - 370C trong 2 giờ. Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật, ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính.
Chủng 1: âm tính Chủng 2: dương tính
Hình 2.4. Thử nghiệm optochin và tan trong muối mật [26]
d/ Sơ đồ phân lập định danh lại vi khuẩn
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập định danh vi khuẩn S. pneumoniae [26] Chủng vi khuẩn lưu mẫu Chủng vi khuẩn lưu mẫu
Cấy trên môi trường thạch máu 37oC, 5% CO2 từ 16 - 24 giờ
Nhận định khuẩn lạc tròn, dẹt, lõm ở giữa, không màu, tan huyết
alpha
Nhuộm Gram Catalase test Optochin test
Đường kính ≥14mm Đường kính <14mm Tan trong muối mật Catalase âm tính Song cầu Gr(+), hoặc chuỗi ngắn
e/ Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn
- Khuẩn lạc vi khuẩn S. pneumoniae trên mơi trường thạch máu 5%: Trịn, nhỏ, dẹt, khơng màu và có xu hướng lõm ở giữa (nhưng có ‘đỉnh’ khi quan sát sớm hơn 14 giờ nuôi cấy), môi trường nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu xanh ve).
- Hình thể vi khuẩn: Hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đơi giống hình cặp kính, cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương.
- Nhạy cảm optochin: Đường kính vịng vơ khuẩn ≥ 14 mm. Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vịng vơ khuẩn từ 9 - 13 mm) nhưng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.