Các gen ermB, mefA và cơ chế kháng kháng sinh họ Macrolide

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.3. KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae

1.3.2.2. Các gen ermB, mefA và cơ chế kháng kháng sinh họ Macrolide

Kháng sinh họ macrolide ức chế vi khuẩn bằng cách kết hợp vào một vị trí chuyên biệt trên tiểu phần ribosome 50S ngăn cản quá trình dịch mã tổng hợp protein. Sự thay đổi cấu trúc của ribosom 50S tại vị trí gắn kết với kháng sinh họ macrolide sẽ dẫn đến sự đề

Chuỗi polysaccharide (peptidoglycan) Kháng sinh beta-lactam transpeptidase (PBPs) bất hoạt Chuỗi polysaccharide (peptidoglycan) Transpeptidase (PBPs) hoạt hóa Peptide Penicillin G Thế hệ thứ nhất Methicillin Thế hệ thứ hai Ampicillin Thế hệ thứ ba Carbenicillin Thế hệ thứ tư Azlocillin Thế hệ thứ tư

kháng nhóm kháng sinh này và có thể cả những nhóm kháng sinh tương đồng khác như lincosamid, tetracycline và streptogramin B. Cơ chế của hiện tượng này được điều hoà bởi gen erm (erythromycin ribosome methylation) tìm thấy trên các plasmid hoặc gen

nhảy (transposon) [153] (Hình 1.11). Bản sao của gen erm sẽ được vận chuyển từ vi

khuẩn này sang vi khuẩn khác nhờ các plasmid hoặc gen nhảy thông qua những kênh tương tự pili. Gen erm sau đó sẽ gắn kết vào bộ gen của vi khuẩn mới, từ đó tổng hợp nên một enzyme có khả năng methyl hố tiểu phần ribosom 50S làm giảm ái lực gắn kết với kháng sinh. Do đó q trình tổng hợp protein không bị ức chế, vi khuẩn tiếp tục tổng hợp các chuỗi polypeptide. Chính nhờ khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein các macrolid được xem là kháng sinh kìm khuẩn. Tuy nhiên, ở nồng độ kháng sinh cao hơn và ít vi khuẩn hoặc khi vi khuẩn phát triển nhanh, các macrolid có tác dụng diệt khuẩn [127, 149].

Cơ chế thứ hai giúp vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm macrolide là nhờ các bơm đẩy thuốc phụ thuộc năng lượng (energy-dependent efflux pumps) được quy định thông tin di truyền bởi gen nhảy mefA (transposable gene). Loại bơm này hoạt động phụ thuộc năng lượng, dẫn đến sự đề kháng ở mức độ trung bình. Bơm nằm ngang với màng tế bào vi khuẩn và đẩy kháng sinh macrolide ra ngoài ngay khi kháng sinh vừa xâm nhập [127, 157].

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng kháng sinh của S. pneumoniae

Sự bùng phát một cách nhanh chóng của các chủng S. pneumoniae kháng kháng

sinh (Drug resistant S. pneumoniae-DRSP) trong suốt 2 thập kỷ qua là một vấn đề sức

khỏe quan trọng trong cộng đồng cũng như trong lâm sàng. Để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh của phế cầu rất nhiều tổ chức sức khỏe cộng đồng và chuyên môn đã đưa ra những chiến lược nhằm hạn chế sự lan truyền của chủng DRSP như can thiệp định hướng sử dụng kháng sinh hợp lý và vắc xin phòng bệnh [111].

Trong kỷ nguyên kháng sinh, kết quả của các bệnh nhiễm trùng được xác định dựa vào mối tương tác giữa tác nhân gây bệnh, kháng sinh và cơ thể chủ. Sự tương tác của ba yếu tố đó quyết định tình trạng kháng thuốc có tiếp tục duy trì một khi xuất hiện trong cộng đồng hay không [111].

1.3.3.1. Các yếu tố liên quan đến tác nhân gây bệnh

Nơi cư trú tự nhiên của S. pneumoniae là vùng mũi họng người. Vi khuẩn phế cầu cư trú trong vùng mũi họng phổ biến hơn ở trẻ em. Khoảng thời gian cư trú của phế cầu bị ảnh hưởng bởi yếu tố liên quan vật chủ như là độ tuổi, và bởi yếu tố liên quan đến tác nhân gây bệnh như là typ huyết thanh. Mặc dù sự cư trú thường khơng có triệu chứng bệnh, nhưng đây là nguồn chính dẫn đến các bệnh nhiễm khuẩn do phế cầu xâm lấn và sự lan truyền phế cầu khuẩn giữa người với người [142].

Đối với một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất, như beta-lactam và macrolide, thì sự thu nhận các gen kháng thuốc của phế cầu xảy ra là kết quả của sự biến nạp hoặc sự thêm đoạn từ các gen trên các transposon tổ hợp. Sự kháng của vi khuẩn đối với những kháng sinh này rất hiếm phát sinh nguyên phát trong cộng đồng dân cư nhạy

cảm với kháng sinh. Điều này trái ngược với khả năng xảy ra có thể dự đốn được của sự giảm mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các kháng sinh fluoroquinolone, cơ chế kháng nhóm kháng sinh này là do những đột biến điểm tự phát. Vì sự kháng beta-lactam không thể tự phát, do đó sự thu nhận chủng DRSP ở một cá thể và sự phát tán của các chủng này trong cộng đồng phải xảy ra thông qua sự lan truyền và phân chia của các dòng vi khuẩn kháng thuốc.

Mặc dù phế cầu có hơn 90 typ huyết thanh, nhưng hầu hết những chủng kháng beta-lactam phân lập được từ lâm sàng mang các typ huyết thanh 6B, 9V, 14, 19F và 23F. Những chủng phế cầu kháng thuốc thuộc typ huyết thanh này thường là những dòng đa kháng thuốc. Tại Mỹ, 70% các chủng phế cầu đa kháng thuốc phân lập được thuộc về các dòng phế cầu kháng thuốc. Các typ huyết thanh này phân bố phổ biến hơn trong những chủng DRSP có thể do những typ này cư trú phổ biến hơn ở trẻ em và có thời gian cư trú dài hơn so với những typ khác, dó đó chúng chịu áp lực chọn lọc lớn hơn từ việc sử dụng kháng sinh với tần suất cao ở nhóm tuổi này. Vì các vắc xin cộng hợp mới có đích tác động là những typ huyết thanh này, do đó những vắc xin này đã được sử dụng với mục tiêu nhằm hạn chế việc lan truyền của các chủng DRSP [35].

Các rào cản tự nhiên về sự phù hợp di truyền cũng có thể hạn chế sự lan truyền của các chủng DRSP. Các gen pbp có sự tương đồng về trình tự, những biến đổi trong các gen này có thể đưa đến sự cạnh tranh về sự tồn tại của vi khuẩn. Trong điều kiện có mặt kháng sinh beta-lactam, vi khuẩn có gen pbp biến đổi trở nên chiếm ưu thế. Khi áp lực

chọn lọc của kháng sinh giảm hoặc mất đi, các chủng DRSP cũng giảm khả năng cạnh tranh tồn tại với các chủng nhạy cảm. Điều này thể hiện ở các chủng phế cầu lâm sàng và thí nghiệm bị đột biến dẫn đến biến đổi cấu trúc các phân tử PBP, những chủng này có khả năng kháng penicillin, nhưng lại giảm khả năng sinh trưởng trong mơt trường khơng có kháng sinh này [44] và giảm độc lực trên chuột [126]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có bằng chứng lâm sàng nào về sự giảm độc lực của các chủng DRSP, và sự lan truyền cũng như sự gây bệnh xâm lấn của những chủng này vẫn xảy ra. Nguyên nhân có thể do những chủng kháng thuốc có khả năng tồn tại trong mũi họng của trẻ nhỏ và người

có hệ miễn dịch suy yếu đã thu nhận các yếu tố bổ sung giúp chúng khôi phục lại độc lực, và cho phép sự lan truyền và gây bệnh diễn ra [50].

1.3.3.2. Các yếu tố liên quan đến kháng sinh

Sử dụng kháng sinh không hợp lý

Mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh rộng rãi trong cộng đồng với sự bùng phát tính kháng thuốc của phế cầu thể hiện rõ ở một số kháng sinh phổ biến như beta- lactam, macrolide và fluoroquinolone [85]. Tình trạng sử dụng kháng sinh hiện nay đã được chứng minh là yếu tố nguy cơ lớn nhất gây ra tình trạng cư trú và lan truyền của các chủng phế cầu kháng thuốc, ở cả mức độ cá thể cũng như cộng đồng, đồng thời cũng liên chặt chẽ đến tỷ lệ các bệnh xâm lấn do phế cầu kháng thuốc gây ra.

Việc sử dụng kháng sinh có thể tạo ra điều kiện thuận lợi cho những chủng kháng thuốc theo một trong hai con đường. Thứ nhất, tác dụng chọn lọc của kháng sinh tạo điều kiện cho sự sinh trưởng của một số lượng nhỏ các chủng kháng thuốc đã có trong quần thể vi khuẩn cư trú hoặc gây bệnh. Thứ hai, kháng sinh tiêu diệt các vi khuẩn khác trong đường mũi họng, từ đó cho phép sự thay thế chủng ưu thế thành những chủng kháng thuốc đang được lưu hành trong suốt hoặc sau quá trình điều trị với kháng sinh. Hai con đường đưa đến sự bùng phát tính kháng thuốc của phế cầu xảy ra với tần suất khác nhau phụ thuộc vào tỷ lệ của các chủng kháng thuốc có trong cộng đồng [134].

Việc sử dụng kháng sinh ngoài y tế cũng là nguyên nhân làm xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc. Tại phần lớn các cơ sở chăn nuôi gia súc, gia cầm của nhà nước cũng như các hộ chăn nuôi cá thể đều dùng kháng sinh, kể cả kháng sinh chữa bệnh cho người được trộn vào thức ăn hàng ngày để phịng bệnh cho vật ni. Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 100% số cơ sở chăn ni có sử dụng chất kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh cho lợn; 68% số cơ sở có sử dụng thức ăn chăn ni chứa kháng sinh để phịng bệnh và kích thích tăng trưởng; 24,04% số cơ sở tự trộn kháng sinh vào thức ăn chăn nuôi để phịng bệnh và kích thích tăng trưởng, trong đó 1,23% số hộ trộn bằng kháng sinh dạng nguyên liệu. Các loại kháng sinh được nhiều cơ sở chăn nuôi

sử dụng là: amoxicilin, tylosin, tetracilin, lincomycin, gentatylo, enrofloxacin, dexamethasone, neomycin [167].

Sử dụng kháng sinh chưa hiệu quả

Việc sử dụng kháng sinh dù hợp lý vẫn có thể tạo điều kiện chọn lọc ưu thế cho các chủng kháng thuốc. Do đó, phác đồ sử dụng kháng sinh vơ cùng quan trọng trong việc hạn chế nguy cơ bùng phát và lan truyền tính kháng thuốc của phế cầu. Cụ thể là, việc điều trị kháng sinh dưới liều có thể làm giảm một cách chọn lọc các chủng nhạy cảm kháng sinh và tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của các dòng kháng thuốc.

Thời gian điều trị bằng kháng sinh kéo dài

Phác đồ điều trị kháng sinh ngắn ngày có hiệu quả tương đương đồng thời làm giảm ưu thế chọn lọc đối với những chủng kháng thuốc. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phác đồ điều trị ngắn ngày và liều cao với beta-lactam có tỷ lệ làm phát sinh ưu thế cư trú của các chủng phế cầu kháng penicillin sau điều trị thấp hơn so với phác đồ dài ngày với liều thấp [135]. Những dữ liệu đó cho thấy rằng, việc lựa chọn kháng sinh hiệu quả và sử dụng phác đồ thích hợp rất quan trọng trong việc ngăn chặn sự bùng phát các chủng kháng thuốc ở từ mức độ cá thể.

1.3.3.3. Các yếu tố liên quan đến vật chủ cảm nhiễm

Sử dụng vắc xin phế cầu cho người

Vắc xin cộng hợp phế cầu có hiệu quả cao trong việc hạn chế sự lan truyền các chủng phế cầu kháng thuốc, dẫn đến làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do các bệnh phế cầu gây ra ở trẻ em. Ước tính chung, khoảng 80% những trường hợp nhiễm khuẩn do phế cầu không nhạy penicillin gây ra thuộc các typ huyết thanh có trong PCV7, và PCV7 có hiệu quả làm giảm 50% tỷ lệ cư trú của các chủng có trong vắc xin. Ngồi ra, vắc xin cịn tạo ra hiệu quả bảo vệ cộng đồng khi tỷ lệ cư trú của các chủng phế cầu mang typ huyết thanh có trong vắc xin đồng thời giảm ở những trẻ không được tiêm chủng với PCV trong cộng đồng [163]. Ngoài ra, sử dụng vắc xin cịn có hiệu quả làm giảm tỷ lệ sử dụng kháng sinh, điều này là do phần nhiều kháng sinh được sử dụng theo kinh nghiệm để điều trị hướng đích nhiễm khuẩn do phế cầu cho những trẻ em có biểu hiện sốt.

Phân tích của Feikin đã chứng minh thấy sự chuyển đổi trong các typ huyết thanh gây bệnh do phế cầu xâm lấn trong suốt thế kỷ trước, cụ thể là những typ huyết thanh từng là ưu thế như 1, 2, 3 và 5 đã bị thay thế bởi các typ 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F và 23F [43]. Các typ ưu thế sau có tỷ lệ được mang và thời gian cư trú dài hơn ở trẻ em so với các typ ưu thế trước đó. Thời gian cư trú kéo dài đã làm tăng khả năng thu nhận tính kháng kháng sinh của các chủng phế cầu. Áp lực chọn lọc của vắc xin cùng với áp lực chọn lọc của kháng sinh đã tạo ra các chủng phế cầu dịng đa kháng thuốc, có khả năng lan truyền cao, độc lực tăng cường, kết hợp với sự chuyển dạng của lớp polysaccharide vỏ tạo thành những chủng mang typ huyết thanh khơng có trong vắc xin.

Sử dụng vắc xin cúm

Mặc dù vắc xin cúm không tác động trực tiếp đến phế cầu, tuy nhiên, việc sử dụng vắc xin cúm có thể liên quan đến việc kiểm soát sự lan truyền của các chủng phế cầu kháng thuốc. Tỷ lệ mắc cúm giảm dẫn đến giảm tỷ lệ sử dụng kháng sinh khơng thích hợp để điều trị cúm, ngồi ra cịn có thể ngăn chặn các bệnh nhiễm khuẩn phế cầu thứ phát sau khi nhiễm vi rút cúm [28].

1.4. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐỐN PHỊNG THÍ NGHIỆM VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC LỰA CHỌN KỸ THUẬT TRONG NGHIÊN CỨU

1.4.1. Xét nghiệm chẩn đoán Streptococcus pneumoniae

Chẩn đốn phịng thí nghiệm là vấn đề cốt lõi của các nghiên cứu căn nguyên gây viêm phổi. Với những tiến bộ gần đây đã đưa ra nhiều phương pháp chẩn đoán mới giúp cải thiện đáng kể khả năng xác định tác nhân gây bệnh đường hô hấp. Tuy nhiên việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi vẫn còn là một thách thức, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Điều này chủ yếu là do sử dụng các kỹ thuật không phù hợp trong các nghiên cứu, khó khăn trong thu thập mẫu bệnh phẩm và phân tích, biện giải kết quả. Các phương pháp chẩn đoán thường quy phịng thí nghiệm được sử dụng trong nhiều thập kỷ qua là: soi kính, ni cấy phân lập bệnh phẩm đường hô hấp, cấy máu, phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu trong máu hoặc phát hiện axid nucleic (kỹ thuật PCR) trong điều kiện phịng thí nghiệm tiêu chuẩn [107].

1.4.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy, định danh

Kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy đờm, bệnh phẩm đường hô hấp dưới (dịch rửa phế quản) và cấy máu trước đây là kỹ thuật chủ yếu để chẩn đoán căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi. Định danh tác nhân đường hô hấp từ các mẫu bệnh phẩm lấy trực tiếp tại vị trí nhiễm khuẩn hoặc từ vị trí vơ trùng khác (như máu) cung cấp bằng chứng chính xác về các vi sinh vật gây bệnh, đây là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán tác nhân vi khuẩn gây bệnh.

Quá trình lấy mẫu ảnh hưởng lớn tới soi kính, ni cấy và phân tích kết quả. Bệnh phẩm đường hơ hấp dưới có thể lẫn với các chất tiết đường hô hấp trên đặc biệt đối với bệnh phẩm là đờm, dẫn đến kết quả sai. Do vậy mẫu đờm phải được kiểm tra chất lượng trước khi xử lý mẫu để khẳng định chắc chắn mẫu được lấy từ đường hơ hấp dưới. Q trình kiểm tra này được đánh giá thơng qua số lượng tế bào biểu mô vảy và tế bào bạch cầu đa nhân trong tiêu bản nhuộm Gram. Sự có mặt của dưới 10 tế bào biểu mô vảy và trên 25 tế bào bạch cầu đa nhân trên một vi trường ở độ phóng đại 3100 được xem là mẫu bệnh phẩm của đường hô hấp dưới ở người lớn [108]. Nhuộm Gram trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và có thể đó chỉ là vi khuẩn chí (sống hội sinh), ngoại trừ các tiêu bản của các bệnh phẩm máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể có bản chất là vơ trùng. Những tiêu bản đờm có giá trị xác định căn nguyên phế cầu chỉ khi số lượng bạch cầu đa nhân tăng lên và thấy có vi khuẩn phế cầu (hình lưỡi mác hay ngọn nến thường nối đơi, cũng có thể đứng đơn lẻ, bắt màu Gram dương) ở bên trong hoặc cả bên ngoài tế bào bạch cầu và kết hợp với số lượng vi khuẩn khi cấy đếm bệnh phẩm đường hô hấp thì có thể định hướng chẩn đoán phế cầu là tác nhân gây viêm đường hô hấp. Bệnh phẩm đường hô hấp dưới thường được cấy trên môi trường thạch máu, chocolate và