463 bp 384 bp 304 bp 250 bp 189 bp 160 bp 566 bp 496 bp 408 bp 248 bp 160 bp 693 bp 573 bp 430 bp 362 bp 280 bp 160 bp 617 bp 514 bp 338 bp 192 bp 816 bp 628 bp 516 bp 371 bp 260 bp 160 bp 655 bp 517 bp 290 bp 199 bp 160 bp 98 bp 574 bp 434 bp 280 bp 201 bp 160 bp 99 bp M PC 14 6 19F 23F 11 PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 1 5 4 18 17 PC
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 10F/C 34 15 19 PC /33C
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
722 bp 643 bp 376 bp 280 bp 160 bp PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 21 33F 20 35B PC
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 35A/C 12 22A/F 23A PC
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 7B 3 9N 10A 9V PC
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
M 24F 8 42F 15A/F 38/25F
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn
PCR NHÓM 7 PCR NHÓM 8 PCR NHÓM 1
PCR NHÓM 2 PCR NHÓM 3
PCR NHÓM 4
Các kháng nguyên vỏ của vi khuẩn S. pneumoniae được sản xuất bởi tổ hợp gen nằm trên cùng một vị trí cps (locus cps) của nhiễm sắc thể, xen kẽ giữa hai gen dexB và
aliA. Trình tự nucleotide của locus cps tương ứng với trên 90 typ huyết thanh của vi khuẩn phế cầu đã được xác định và là cơ sở cho việc phân loại vi khuẩn S. pneumoniae
dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử [13]. Trong nghiên cứu này, đã áp dụng phương pháp PCR đa mồi của CDC [26], tuy nhiên quy trình xét nghiệm của chúng tơi có điểm khác biệt do sự khác biệt về sự phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae giữa
hai quốc gia nên có sự khác biệt trong việc sắp xếp tổ hợp các mồi ở mỗi phản ứng PCR. Sử dụng 36 cặp mồi xác định 40 typ huyết thanh của phế cầu, được chia thành 8 nhóm phản ứng (mỗi phản ứng có khoảng 4-6 cặp mồi). Đây là những typ huyết thanh phổ biến gây bệnh của phế cầu.
Quy trình được thiết lập sao cho các typ huyết thanh thường gặp ở Việt Nam sẽ được sắp xếp lần lượt theo tần suất xuất hiện từ cao xuống thấp và được phát hiện lần lượt theo thứ tự từ nhóm phản ứng PCR 1 đến nhóm phản ứng PCR 8. Thiết kế quy trình này sẽ làm giảm chi phí khi xét nghiệm mẫu. Phân biệt các typ huyết thanh của S. pneumoniae dựa trên kích thước sản phẩm PCR trên gel agarose. Hình ảnh điện di kết quả tối ưu hóa quy trình của 8 nhóm phản ứng PCR được thể hiện trong Hình 3.2.
Sau đây là bảng kết quả số lượng các typ huyết thanh ở các nhóm phản ứng áp dụng quy trình được cải tiến tổ hợp mồi và so với áp dụng quy trình của CDC.
Bảng 3.2. Số lượng các typ huyết thanh phân bố ở các nhóm phản ứng, n=331
Nhóm phản ứng PCR
Kết quả của nghiên cứu này Kết quả áp dụng quy trình CDC Số typ huyết thanh
phát hiện được Số lượng (%)
Số typ huyết thanh
phát hiện được Số lượng (%)
Nhóm 1 5/5 277 (83,7%) 3/5 96 (29%) Nhóm 2 3/5 28 (8,5%) 1/5 5 (2%) Nhóm 3 2/5 7 (2,1%) 2/5 118 (36%) Nhóm 4 2/5 5 (1,5%) 1/5 1 (0,3%) Nhóm 5 1/4 5 (1,5%) 3/5 50 (15%) Nhóm 6, 7, 8 0/16 0 (0%) 1/16 3 (1%)
Hiệu quả của việc cải tiến quy trình: Trong số 331 chủng S.pneumoniae có tới 83,7% số chủng chỉ cần thực hiện 1 phản ứng PCR, 8,5% số chủng thực hiện 2 phản ứng, 2,1% số chủng thực hiện 3 phản ứng, số chủng thực hiện 3 và 4 phản ứng đều chỉ có 1,5%. Chỉ có 33 chủng (9,97%) phải chạy hết cả 8 nhóm phản ứng tuy nhiên khơng có nhóm nào dương tính. Với cách sắp xếp các typ nổi trội được đưa lên các nhóm phản ứng đầu như vậy sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian và nguồn lực do hạn chế được số lần thực hiện xét nghiệm. Đây được xem là điểm mới, cải tiến của luận án. Nếu áp dụng hồn tồn cơng thức các tổ hợp mồi của CDC áp dụng tại Mỹ thì chỉ có 96 chủng vi khuẩn chiếm tỷ lệ 29% thực hiện 1 phản ứng PCR đầu tiên, có tới 118 (36%) phải chạy 3 phản ứng (thời gian và chi phí tăng gấp 3 lần) và có 50 (15%) phải chạy tới 5 phản ứng (thời gian và chi phí tăng gấp 5 lần). Bên cạnh đó số lượng các chủng khơng định typ lên tới 18% so với quy trình của chúng tơi chỉ có 9,97%. Đây chính là lý do quy trình khơng thể áp dụng được cho các nước, các khu vực khác nhau mà cần phải cải tiến theo tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh ưu thế ở mỗi một khu vực để có một quy trình tối ưu nhất.
Nghiên cứu sử dụng trình tự mồi đã được cơng bố bởi CDC - Hoa Kỳ. Trong số 331 chủng vi khuẩn S. pneumoniae tiến hành định typ huyết thanh có 33 chủng (9,97%)
chưa định được typ huyết thanh, trong đó 12 chủng âm tính với gen cpsA. Đây có thể là
các chủng phế cầu khơng vỏ hoặc thuộc nhóm các typ huyết thanh hiếm gặp hoặc khơng bao gồm trong các typ huyết thanh đã được thiết kế mồi. Mặc dù có trên 90 typ huyết thanh nhưng chỉ có khoảng 20 typ gây bệnh chủ yếu. Một nghiên cứu toàn cầu trên 60.090 chủng phân lập từ 70 quốc gia đã ước tính các typ huyết thanh gây ra bệnh phế cầu xâm lấn ở trẻ dưới 5 tuổi ở các vùng khác nhau: 6 kiểu typ huyết thanh được xác định là gây ra bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở Bắc Mỹ; 9 kiểu serotypes ở châu Phi; và 11 serotypes ở châu Á [79]. Bên cạnh đó, mặc dù sự tồn tại của trên 90 typ huyết thanh gây trở ngại trong việc định typ dựa trên các kỹ thuật di truyền, tuy nhiên gần đây việc giải trình tự tất cả các typ huyết thanh đã làm tăng triển vọng để đạt được mục đích này. Do vậy việc xác định được toàn bộ các typ huyết thanh phế cầu phổ biến gây bệnh nghiêm trọng là một tiếp cận đầy hứa hẹn.
Một số hình ảnh điện di của kỹ thuật PCR đa mồi xác định typ huyết thanh trên chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm: