CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
Tất cả các khía cạnh liên quan đến vấn đề y đức trong nghiên cứu này đã được thơng qua hội đồng y đức có thẩm quyền phê duyệt.
Thu thập thơng tin và chủng vi khuẩn S. pneumoniae
Định danh lại các chủng S.
pneumoniae từ bệnh viện bằng kỹ
thuật nuôi cấy
40 chủng chuẩn serotype (CDC) và 5 chủng chuẩn gen kháng kháng sinh
(Nagasaki) Tiếp tục khẳng định bằng kỹ
thuật PCR (lytA, cpsA đặc hiệu)
331 chủng S. pneumoniae Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) n=331, và ATCC49619 40 chủng chuẩn serotyp Áp dụng và cải tiến quy trình PCR đa mồi xác định typ HT Xác định typ huyết thanh, n=331, 40 chủng chuẩn làm chứng dương 5 chủng chuẩn gen kháng KS Áp dụng và cải tiến quy trình PCR đa mồi xác định gen kháng KS Xác định gen kháng kháng sinh, n=331 và 5 chủng chuẩn làm chứng dương
2.2.7. Xử lý và phân tích số liệu
Số liệu thu thập sẽ được nhập 2 lần độc lập bằng phần mềm EpiData và xử lý, phân tích bằng phần mềm Stata 14 và Excel.
2.2.8. Các kỹ thuật phịng thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu
2.2.8.1. Kỹ thuật định danh lại vi khuẩn bằng nuôi cấy phân lập
a/ Phương pháp thu thập, bảo quản và vận chuyển chủng vi khuẩn
Bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ được phân lập và định danh theo thường qui xét nghiệm của các bệnh viện. Vi khuẩn S. pneumoniae đã định danh được bảo quản ở tủ âm sâu -80oC trong môi trường giữ chủng gồm canh thang BHI và 20% glycerol, vận chuyển về Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bằng dây chuyền lạnh không tan đông, sử dụng đá khô. Bảo quản ở tủ âm sâu nhiệt độ -80oC cho đến khi được khôi phục và định danh lại.
b/ Nuôi cấy chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae [5, 26]
- Môi trường và sinh phẩm: Thạch máu 5% (cừu hoặc thỏ), canh thang giàu dinh dưỡng (canh thang trypticasein soy hoặc brain-heart infusion (BHI) có 5% máu cừu. Khoanh giấy optochin (ethylhydrocuprein), bột muối mật (deoxycholate), nước muối sinh lý (NaCl 0,9%).
- Chủng vi khuẩn lưu tại tủ âm sâu của phịng thí nghiệm được cấy tăng sinh trên canh thang trypticasein soy, sau đó ria cấy trên môi trường thạch máu 5% để thu được khuẩn lạc thuần.
- Điều kiện nuôi cấy: Các môi trường nuôi cấy phân lập phế cầu được ủ ấm trong
khí trường 37oC, 5% CO2 từ 16 - 24 giờ.
- Quan sát khuẩn lạc: Sau 16 - 24 giờ, các khuẩn lạc của phế cầu có vỏ trịn, dẹt,
nhỏ (0,5 - 1,5 mm), khơng màu, có xu hướng lõm giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Lấy một khuẩn lạc cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ 370C, 5% CO2 trong 16 giờ để làm thêm các thử nghiệm xác định.
K. pneumoniae, tan huyết
gamma
S. pneumoniae, tan huyết alpha S. aureus, tan huyết beta
Hình 2.3. Khuẩn lạc một số vi khuẩn trên môi trường thạch máu [26]
c/ Các thử nghiệm xác định S. pneumoniae
Thử nghiệm Optochin: Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin đường kính 6 mm (chứa 5μg chất ethylhydrocuprein), ủ 35 - 37oC và 5% CO2. Quan sát sau 16 - 24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy khơng có vịng vơ khuẩn có nghĩa đó chỉ là Viridans streptococci, nếu có
vịng vơ khuẩn có đường kính ≥ 14 mm là phế cầu, nếu vịng vơ khuẩn từ 9 - 13 mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility): Từ nuôi cấy thuần và mới (16
- 24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục >0,5 Mc Farland. Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25 ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25 ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25 ml muối mật 10% (deoxycholat), lắc nhẹ, ủ 35 - 370C trong 2 giờ. Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật, ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính.
Chủng 1: âm tính Chủng 2: dương tính
Hình 2.4. Thử nghiệm optochin và tan trong muối mật [26]
d/ Sơ đồ phân lập định danh lại vi khuẩn
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập định danh vi khuẩn S. pneumoniae [26] Chủng vi khuẩn lưu mẫu Chủng vi khuẩn lưu mẫu
Cấy trên môi trường thạch máu 37oC, 5% CO2 từ 16 - 24 giờ
Nhận định khuẩn lạc trịn, dẹt, lõm ở giữa, khơng màu, tan huyết
alpha
Nhuộm Gram Catalase test Optochin test
Đường kính ≥14mm Đường kính <14mm Tan trong muối mật Catalase âm tính Song cầu Gr(+), hoặc chuỗi ngắn
e/ Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn
- Khuẩn lạc vi khuẩn S. pneumoniae trên mơi trường thạch máu 5%: Trịn, nhỏ, dẹt, khơng màu và có xu hướng lõm ở giữa (nhưng có ‘đỉnh’ khi quan sát sớm hơn 14 giờ nuôi cấy), môi trường nuôi cấy xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha (màu xanh ve).
- Hình thể vi khuẩn: Hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đơi giống hình cặp kính, cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương.
- Nhạy cảm optochin: Đường kính vịng vơ khuẩn ≥ 14 mm. Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vịng vơ khuẩn từ 9 - 13 mm) nhưng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.
2.2.8.2. Kỹ thuật khẳng định phế cầu khuẩn bằng PCR
a/ Tách chiết ADN của các chủng S. pneumoniae
Tiến hành tách chiết 331 chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng,
36 chủng chuẩn do CDC cung cấp tương ứng với các typ huyết thanh khác nhau và 5 chủng chuẩn do Nagasaki cung cấp mang tương ứng các gen pbp1A, pbp2X, pbp2B, ermB và mefA tương ứng.
Sản phẩm của quá trình tách chiết ADN các chủng chuẩn được sử dụng làm chứng dương cho các kỹ thuật tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh và PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh. Đồng thời được sử dụng làm chứng dương cho các thử nghiệm PCR với chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm.
Sản phẩm của quá trình tách chiết 331 chủng vi khuẩn từ bệnh phẩm được sử dụng cho kỹ thuật PCR để khẳng định phế cầu khuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu lytA và cpsA và
các kỹ thuật PCR xác định typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh.
Trước khi tiến hành tách chiết ADN các chủng vi khuẩn được cấy thuần trên môi trường thạch TSA với 5% máu cừu trong 18-20 giờ ở 37oC và 5% CO2, các chủng phế cầu không thuần sẽ được cấy chuyển để tạo ra chủng thuần. Tiến hành định danh lại bằng cách đặt khoanh giấy optochin. Bộ kit tách chiết của hãng QIAgene được sử dụng. Dung
dịch đệm TE được dùng để bảo quản ADN, sau cùng ADN được giữ ở -400C cho các phân tích tiếp theo.
b/ Kỹ thuật PCR khẳng định lại các chủng S. pneumoniae
Hai gen lytA và cpsA là những gen quan trọng và có mặt ở gần như tồn bộ các typ huyết thanh của phế cầu. Vì thế chúng được lựa chọn làm gen sàng lọc xác định hay là nội đối chứng trong các phản ứng PCR định typ huyết thanh và xác định gen kháng thuốc của
S. pneumoniae. Trình tự của 2 cặp mồi cpsA và lytA tương ứng cho ra sản phẩm có kích
thước 160bp và 319 bp (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Trình tự các mồi của gen lytA và cpsA [26, 164]
Mồi Trình tự Kích thước (bp)
cpsA – F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
160
cpsA – R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
lytA – 681F CAA CCG TAC AGA ATG AAG GG
319
lytA – 999R TTA TTC GTG CAA TAC TCG TGC G
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi lytA và cpsA
PCR đa mồi
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối cùng
Nước tinh khiết
Đệm PCR 1X Mg2+ 2mM dNTP 200µM cpsA-F 0,3µM cpsA-R 0,3µM LytA-F 0,3µM LytA-R 0,3µM Taq polymerase 1 U ADN mẫu
94 (3 phút), (94 (30 giây), 56 (60 giây), 65 (60 giây)) x 30 chu kỳ, 72 (10 phút)
Thể tích phản ứng PCR là 20µl với các thành phần, nồng độ và điều kiện phản ứng như mô tả ở Bảng 2.4. Kết quả của phản ứng PCR đa mồi được kiểm tra bằng phương pháp điện di sản phẩm trên agarose 2% (1 Nusieve:1 Seakem) có bổ sung thuốc nhuộm ADN là redsafe (theo tỷ lệ thuốc nhuộm : thể tích thạch là 1:20.000).
2.2.8.3. Thử nghiệm "Quellung" xác định typ huyết thanh [5, 26]
- Nguyên lý: Phản ứng Quellung dương tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu loài gắn với thành phần polysaccharid của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dưới dạng "phình vỏ".
- Trong nghiên cứu này thử nghiệm Quellung được thực hiện với 36 chủng chuẩn do CDC cung cấp.
- Nguyên vật liệu: Bộ kháng huyết thanh đặc hiệu typ huyết thanh; dung dịch xanh methylen 3%; canh thang BHI. Pipetman và đầu cơn; que trộn; lam kính, lamen; kính hiển vi quang học.
- Cách tiến hành:
+ Nuôi cấy chủng vi khuẩn S. pneumoniae cần định typ huyết thanh trong canh thang tăng sinh BHI từ 6-12 giờ để có canh khuẩn có độ đục khoảng 1-2 McFarland.
+ Trên mỗi lam kính, ghi mã chủng vi khuẩn cần thử nghiệm và khoanh 3 vòng tròn cho 3 phản ứng.
+ Dùng pipetman lấy 4μl canh khuẩn nhỏ lên mỗi vòng tròn của 3 vòng tròn trên lam kính cho 3 phản ứng.
+ Với mỗi phản ứng, lấy 4μl dung dịch xanh methylen nhỏ lên 1 vịng trịn trên lam kính.
+ Với mỗi phản ứng, lấy 4μl dung dịch kháng huyết thanh đặc hiệu typ nhỏ lên 1 vịng trịn trên lam kính.
+ Trộn đều các dung dịch bằng que trộn, thay mỗi que trộn cho 1 phản ứng, đậy lamen.
+ Quan sát hiện tượng phồng vỏ của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400X (40x10).
- Đọc kết quả: Dương tính: Xuất hiện hiện tượng phồng vỏ: Vỏ vi khuẩn phồng lên, biến dạng. Hình ảnh quan sát thấy là: Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh tế bào có một quầng với đường viền sắc nét, đó là gờ ngồi của vỏ (do ánh sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu).
Âm tính Dương tính
Hình 2.6. Hình ảnh phồng vỏ của phế cầu độ phóng đại 400X [26]
2.2.8.4. Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh
a/ Các mồi (primers)
Các mồi được sử dụng để xác định typ huyết thanh phế cầu được tham khảo của CDC.
Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định typ huyết thanh phế cầu [26]
Mồi Trình tự Nồng độ cuối
(µM)
Kích thước (bp)
Nhóm phản ứng PCR 1
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC 14-F GAA ATG TTA CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT
0,3 189
14-R GCC AAT ACT TCT TAG TCT CTC AGA TGA AT 6-F AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT ATC TGG
0,3 250
6-R TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA 19F-F GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT ATC C
0,3 304
19F-R GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG 23F-F
Mồi Trình tự Nồng độ cuối (µM)
Kích thước (bp)
23F-R CAC AAC ACC TAA CAC ACG ATG GCT ATA TGA TTC 11-F GGA CAT GTT CAG GTG ATT TCC CAA TAT AGT G
0,5 463
11-R GAT TAT GAG TGT AAT TTA TTC CAA CTT CTC CC
Nhóm phản ứng PCR 2
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
10F/C/33C-F
GGA GTT TAT CGG TAG TGC TCA TTT TAG CA
1 248
10F/C/33C-R
CTA ACA AAT TCG CAA CAC GAG GCA ACA 34-F
GCT TTT GTA AGA GGA GAT TAT TTT CAC CCA AC
0,2 408
34-R
CAA TCC GAC TAA GTC TTC AGT AAA AAA CTT TAC 15B/C-F
TTG GAA TTT TTT AAT TAG TGG CTT ACC TA
0,3 496
15B/C-R
CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC C 19A-F
GTT AGT CCT GTT TTA GAT TTA TTT GGT GAT GT
0,5 566
19A-R
GAG CAG TCA ATA AGA TGA GAC GAT AGT TAG
Nhóm phản ứng PCR 3
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
1-F
CTC TAT AGA ATG GAG TAT ATA AAC TAT GGT TA
0,7 280
1-R
CCA AAG AAA ATA CTA ACA TTA TCA CAA TAT TGG C 5-F
ATA CCT ACA CAA CTT CTG ATT ATG CCT TTG TG
0.7 362
5-R
GCT CGA TAA ACA TAA TCA ATA TTT GAA AAA GTA TG 4-F
CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G
0,3 430
4-R
GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G 18-F
CTT AAT AGC TCT CAT TAT TCT TTT TTT AAG CC
0,5 573
18-R
TTA TCT GTA AAC CAT ATC AGC ATC TGA AAC 17F-F
TTC GTG ATG ATA ATT CCA ATG ATC AAA CAA GAG
1 693
17F-R
GAT GTA ACA AAT TTG TAG CGA CTA AGG TCT GC
Nhóm phản ứng PCR 4
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
7B/C-F
CTA TCT CAG TCA TCT ATT GTT AAA GTT TAC GAC GGG A 0,2 260 7B/C-R
GAA CAT AGA TGT TGA GAC ATC TTT TGT AAT TTC 3-F
ATG GTG TGA TTT CTC CTA GAT TGG AAA GTA G
0,2 371
3-R
CTT CTC CAA TTG CTT ACC AAG TGC AAT AAC G 9N/L-F
GAA CTG AAT AAG TCA GAT TTA ATC AGC 0,2 516 9N/L-R
ACC AAG ATC TGA CGG GCT AAT CAA T 10A-F
GGT GTA GAT TTA CCA TTA GTG TCG GCA GAC
0,3 628
10A-R
GAA TTT CTT CTT TAA GAT TCG GAT ATT TCT C 9V/A-F
Mồi Trình tự Nồng độ cuối (µM)
Kích thước (bp)
9V/A-R
CCA TGA ATG AAA TCA ACA TTG TCA GTA GC
Nhóm phản ứng PCR 5
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
35A/C-F
ATT ACG ACT CCT TAT GTG ACG CGC ATA
0,2 280
35A/C-R
CCA ATC CCA AGA TAT ATG CAA CTA GGT T 12-F
GCA ACA AAC GGC GTG AAA GTA GTT G 0,3 376 12-R
CAA GAT GAA TAT CAC TAC CAA TAA CAA AAC 22A/F-F
GAG TAT AGC CAG ATT ATG GCA GTT TTA TTG TC
0,3 643
22A/F-R
CTC CAG CAC TTG CGC TGG AAA CAA CAG ACA AC 23A-F
TAT TCT AGC AAG TGA CGA AGA TGC G
1 722
23A-R
CCA ACA TGC TTA AAA ACG CTG CTT TAC
Nhóm phản ứng PCR 6
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
21-F
CTA TGG TTA TTT CAA CTC AAT CGT CAC C
0,2 192
21-R
GGC AAA CTC AGA CAT AGT ATA GCA TAG 33F-F
GAA GGC AAT CAA TGT GAT TGT GTC GCG
0,3 338
33F-R
CTT CAA AAT GAA GAT TAT AGT ACC CTT CTA C 20-F
GAG CAA GAG TTT TTC ACC TGA CAG CGA GAA G
0,5 514
20-R
CTA AAT TCC TGT AAT TTA GCT AAA ACT CTT ATC 35B-F
GAT AAG TCT GTT GTG GAG ACT TAA AAA GAA TG
1,2 617
35B-R
CTT TCC AGA TAA TTA CAG GTA TTC CTG AAG CAA G
Nhóm phản ứng PCR 7
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
39-F
TCA TTG TAT TAA CCC TAT GCT TTA TTG GTG
0,4 98
39-R
GAG TAT CTC CAT TGT ATT GAA ATC TAC CAA 23B-F
CCA CAA TTA GCG CTA TAT TCA TTC AAT CG
0,1 199
23B-R
GTC CAC GCT GAA TAA AAT GAA GCT CCG 2-F
TAT CCC AGT TCA ATA TTT CTC CAC TAC ACC
0,5 290
2-R
ACA CAA AAT ATA GGC AGA GAG AGA CTA CT 35F/47F-F
GAA CAT AGT CGC TAT TGT ATT TTA TTT AAA GCA A
0,7 517
35F/47F-R