CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8.2. Kỹ thuật khẳng định phế cầu khuẩn bằng PCR
a/ Tách chiết ADN của các chủng S. pneumoniae
Tiến hành tách chiết 331 chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng,
36 chủng chuẩn do CDC cung cấp tương ứng với các typ huyết thanh khác nhau và 5 chủng chuẩn do Nagasaki cung cấp mang tương ứng các gen pbp1A, pbp2X, pbp2B, ermB và mefA tương ứng.
Sản phẩm của quá trình tách chiết ADN các chủng chuẩn được sử dụng làm chứng dương cho các kỹ thuật tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh và PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh. Đồng thời được sử dụng làm chứng dương cho các thử nghiệm PCR với chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm.
Sản phẩm của quá trình tách chiết 331 chủng vi khuẩn từ bệnh phẩm được sử dụng cho kỹ thuật PCR để khẳng định phế cầu khuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu lytA và cpsA và
các kỹ thuật PCR xác định typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh.
Trước khi tiến hành tách chiết ADN các chủng vi khuẩn được cấy thuần trên môi trường thạch TSA với 5% máu cừu trong 18-20 giờ ở 37oC và 5% CO2, các chủng phế cầu không thuần sẽ được cấy chuyển để tạo ra chủng thuần. Tiến hành định danh lại bằng cách đặt khoanh giấy optochin. Bộ kit tách chiết của hãng QIAgene được sử dụng. Dung
dịch đệm TE được dùng để bảo quản ADN, sau cùng ADN được giữ ở -400C cho các phân tích tiếp theo.
b/ Kỹ thuật PCR khẳng định lại các chủng S. pneumoniae
Hai gen lytA và cpsA là những gen quan trọng và có mặt ở gần như tồn bộ các typ huyết thanh của phế cầu. Vì thế chúng được lựa chọn làm gen sàng lọc xác định hay là nội đối chứng trong các phản ứng PCR định typ huyết thanh và xác định gen kháng thuốc của
S. pneumoniae. Trình tự của 2 cặp mồi cpsA và lytA tương ứng cho ra sản phẩm có kích
thước 160bp và 319 bp (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Trình tự các mồi của gen lytA và cpsA [26, 164]
Mồi Trình tự Kích thước (bp)
cpsA – F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
160
cpsA – R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
lytA – 681F CAA CCG TAC AGA ATG AAG GG
319
lytA – 999R TTA TTC GTG CAA TAC TCG TGC G
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi lytA và cpsA
PCR đa mồi
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối cùng
Nước tinh khiết
Đệm PCR 1X Mg2+ 2mM dNTP 200µM cpsA-F 0,3µM cpsA-R 0,3µM LytA-F 0,3µM LytA-R 0,3µM Taq polymerase 1 U ADN mẫu
94 (3 phút), (94 (30 giây), 56 (60 giây), 65 (60 giây)) x 30 chu kỳ, 72 (10 phút)
Thể tích phản ứng PCR là 20µl với các thành phần, nồng độ và điều kiện phản ứng như mô tả ở Bảng 2.4. Kết quả của phản ứng PCR đa mồi được kiểm tra bằng phương pháp điện di sản phẩm trên agarose 2% (1 Nusieve:1 Seakem) có bổ sung thuốc nhuộm ADN là redsafe (theo tỷ lệ thuốc nhuộm : thể tích thạch là 1:20.000).