Nhóm phản ứng PCR
Kết quả của nghiên cứu này Kết quả áp dụng quy trình CDC Số typ huyết thanh
phát hiện được Số lượng (%)
Số typ huyết thanh
phát hiện được Số lượng (%)
Nhóm 1 5/5 277 (83,7%) 3/5 96 (29%) Nhóm 2 3/5 28 (8,5%) 1/5 5 (2%) Nhóm 3 2/5 7 (2,1%) 2/5 118 (36%) Nhóm 4 2/5 5 (1,5%) 1/5 1 (0,3%) Nhóm 5 1/4 5 (1,5%) 3/5 50 (15%) Nhóm 6, 7, 8 0/16 0 (0%) 1/16 3 (1%)
Hiệu quả của việc cải tiến quy trình: Trong số 331 chủng S.pneumoniae có tới 83,7% số chủng chỉ cần thực hiện 1 phản ứng PCR, 8,5% số chủng thực hiện 2 phản ứng, 2,1% số chủng thực hiện 3 phản ứng, số chủng thực hiện 3 và 4 phản ứng đều chỉ có 1,5%. Chỉ có 33 chủng (9,97%) phải chạy hết cả 8 nhóm phản ứng tuy nhiên khơng có nhóm nào dương tính. Với cách sắp xếp các typ nổi trội được đưa lên các nhóm phản ứng đầu như vậy sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian và nguồn lực do hạn chế được số lần thực hiện xét nghiệm. Đây được xem là điểm mới, cải tiến của luận án. Nếu áp dụng hồn tồn cơng thức các tổ hợp mồi của CDC áp dụng tại Mỹ thì chỉ có 96 chủng vi khuẩn chiếm tỷ lệ 29% thực hiện 1 phản ứng PCR đầu tiên, có tới 118 (36%) phải chạy 3 phản ứng (thời gian và chi phí tăng gấp 3 lần) và có 50 (15%) phải chạy tới 5 phản ứng (thời gian và chi phí tăng gấp 5 lần). Bên cạnh đó số lượng các chủng khơng định typ lên tới 18% so với quy trình của chúng tơi chỉ có 9,97%. Đây chính là lý do quy trình khơng thể áp dụng được cho các nước, các khu vực khác nhau mà cần phải cải tiến theo tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh ưu thế ở mỗi một khu vực để có một quy trình tối ưu nhất.
Nghiên cứu sử dụng trình tự mồi đã được công bố bởi CDC - Hoa Kỳ. Trong số 331 chủng vi khuẩn S. pneumoniae tiến hành định typ huyết thanh có 33 chủng (9,97%)
chưa định được typ huyết thanh, trong đó 12 chủng âm tính với gen cpsA. Đây có thể là
các chủng phế cầu khơng vỏ hoặc thuộc nhóm các typ huyết thanh hiếm gặp hoặc khơng bao gồm trong các typ huyết thanh đã được thiết kế mồi. Mặc dù có trên 90 typ huyết thanh nhưng chỉ có khoảng 20 typ gây bệnh chủ yếu. Một nghiên cứu toàn cầu trên 60.090 chủng phân lập từ 70 quốc gia đã ước tính các typ huyết thanh gây ra bệnh phế cầu xâm lấn ở trẻ dưới 5 tuổi ở các vùng khác nhau: 6 kiểu typ huyết thanh được xác định là gây ra bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở Bắc Mỹ; 9 kiểu serotypes ở châu Phi; và 11 serotypes ở châu Á [79]. Bên cạnh đó, mặc dù sự tồn tại của trên 90 typ huyết thanh gây trở ngại trong việc định typ dựa trên các kỹ thuật di truyền, tuy nhiên gần đây việc giải trình tự tất cả các typ huyết thanh đã làm tăng triển vọng để đạt được mục đích này. Do vậy việc xác định được toàn bộ các typ huyết thanh phế cầu phổ biến gây bệnh nghiêm trọng là một tiếp cận đầy hứa hẹn.
Một số hình ảnh điện di của kỹ thuật PCR đa mồi xác định typ huyết thanh trên chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm:
Hình 3.3. Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 1
Hình 3.4. Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 2
Hình 3.5. Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 3
M PC 6 19F 23F 11 NT 19F 23F 14 NT NT 6 23F 6A/B 6A/B (-)
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chúng âm
M PC NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT (-) 18 NT
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chứng âm
PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn NT: Không định typ (-): Chứng âm
Độ nhạy: Mục tiêu của nghiên cứu là xác định các typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn S. pneumoniae nhằm cung cấp số liệu dịch tễ học typ huyết thanh của phế cầu
khuẩn, từ đó đưa ra chiến lược dự phịng vắc xin thích hợp cho nhóm trẻ dưới 5 tuổi tại Việt Nam. Do vậy chúng tôi tiến hành kỹ thuật trên các chủng đã phân lập từ bệnh phẩm. Với việc tách chiết ADN cho phản ứng PCR từ chủng vi khuẩn thì nồng độ ADN tách chiết lớn, việc xác định độ nhạy của kỹ thuật không cấp thiết trong nghiên cứu này.
3.2.2. Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định gen kháng kháng sinh
Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae (chủ yếu là β-
lactam và macrolide) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối với các protein gắn penicillin (pbp1A, pbp2X, pbp2B) hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích (methyl hóa
ribosom) do gen ermB (gây kháng đồng thời nhiều dòng kháng sinh của macrolides,
clindamycine và tetracycline) hoặc hình thành các bơm sinh học giúp đẩy kháng sinh ra ngoài ngay khi kháng sinh vừa xâm nhập do các gen mefA, mefE.
Nghiên cứu áp dụng quy trình của Nagai và cộng sự năm 2001. Tuy nhiên chúng tơi có cải tiến về việc kết hợp các mồi cho phản ứng. Quy trình của Nagai bao gồm 3 phản ứng với 6 cặp mồi: phản ứng PCR1 (lytA và pbp1A), phản ứng PCR2 (pbp2X và pbp2B)
và phản ứng PCR3 (mefA và ermB) [110]. Nghiên cứu đã xây dựng được kỹ thuật PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh với 2 phản ứng PCR. Phản ứng 1 sử dụng 4 cặp mồi của các gen lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B (kích thước tương ứng: 319 bp, 238 bp, 197bp
và 147 bp) phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và gen đặc hiệu cho phế cầu khuẩn lytA làm mẫu nội chứng. Phản ứng 2 sử dụng 2 cặp mồi là mefA và ermB (kích thước tương ứng là 293 bp và 224 bp). Sự kết hợp này đã giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và công sức 1/3 lần so với quy trình ban đầu. Hình ảnh điện di sản phẩm của quy trình sau đây:
M: Marker, 1-4 và 6-7: đơn mồi, 5: lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B, 8: mefA, ermB, (-): chứng âm.
Hình 3.6. Ảnh điện di tối ưu hóa quy trình xác định gen kháng kháng sinh Một số hình ảnh thực hiện trên chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm: Một số hình ảnh thực hiện trên chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm:
M: Marker; (+): chứng dương lytA(319bp), pbp1A(238bp), pbp2X(197bp), pbp2B(147) 1-13: Các chủng S.pneumoniae; (-): chứng âm
Hình 3.7. Ảnh điện di xác định các gen kháng kháng sinh pbp1a, pbp2x và pbp2b
M: Marker; (+): chứng dương mefA(294bp) và ermB (224bp); 1-13: Các chủng S.pneumoniae; (-): chứng âm
Hình 3.8. Ảnh điện di xác định các gen kháng kháng sinh mefA và ermB
294 bp 224 bp 319 bp 238 bp 197 bp 147 bp
3.3. XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CÁC TYP HUYẾT THANH PHẾ CẦU GÂY BỆNH TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ở VIỆT NAM
3.3.1. Kết quả phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae
Việc xác định các typ huyết thanh phế cầu có tầm quan trọng đặc biệt vì sự phát triển của vắc xin hiện nay cần có các thơng tin chính xác về các typ huyết thanh đang lưu hành. Bên cạnh đó việc giám sát biến động về các typ huyết thanh qua các giai đoạn cũng rất cần thiết sau quá trình triển khai tiêm vắc xin cộng hợp PCV7, PCV10. Từ đó để dự tính về khả năng thay thế các typ huyết thanh khơng có trong vắc xin có thể trở nên ưu thế. Chẳng hạn như gần đây sự gia tăng typ 19A phân lập được ở bệnh nhi tại Mỹ trong khoảng thời gian sau tiêm chủng làm nổi bật nhu cầu cần thiết phải giám sát liên tục về mặt dịch tễ học các typ huyết thanh [115]. Điều này cũng dẫn đến cần thiết phải phát triển một phương pháp xác định chính xác và hiệu quả các typ huyết thanh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã áp dụng quy trình của CDC để xây dựng quy trình của phịng thí nghiệm trong chương trình giám sát của mình. Sử dụng 36 cặp mồi được phân chia thành tám phản ứng PCR đa mồi. Các phản ứng được thiết kế tuần tự bao gồm các typ huyết thanh thường gặp nhất.
Tổng số 331 chủng S. pneumoniae được tiến hành xác định typ huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi đã xác định được 13 kiểu typ huyết thanh (Hình 3.9). Các typ huyết thanh chiếm tỷ lệ vượt trội là 19F (93 chủng/28,1%), 6A/B (84 chủng/25,4%), 23F(43 chủng/13%), 14(32 chủng/9,7%) và 11(25 chủng/7,6%). Các typ còn lại chiếm tỷ lệ thấp hơn là 15B/C (15 chủng/4,5%), 19A (10 chủng/3%), 17F (6 chủng/1,8%), 23A (5 chủng/1,5%), 10A (3 chủng/0,9%), 34 (3 chủng/0,9%), 3 (2 chủng/0,6%), và 18 (1 chủng/0,3%).
Hình 3.9. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại 3 bệnh viện thuộc phạm vi nghiên cứu So sánh kết quả của chúng tôi với nghiên cứu của Stanley S. Tai về tỷ lệ lưu hành các typ phế cầu tại 7 nước khu vực châu Á. Các typ huyết thanh nổi trội được bao phủ trong vắc xin PCV7 là 19F, 23F, 6B, 14 nhưng chiếm tỷ lệ khác nhau ở các Quốc gia. Tại Trung Quốc chủ yếu là các typ huyết thanh 19F, 23F, 6B, 19A, 14 (tỷ lệ tương ứng là 27.6 %, 11,7%, 8,3%, 8,0%, 7,3%), Hồng Kông là 14, 6B, 23F, 19F, 18C (tỷ lệ tương ứng là 34.2%, 19.8%, 17.6%, 10.1%, 5.0%, Nhật Bản là 6B, 19F, 23F, 14, 6A ( tỷ lệ tương ứng 21.9%, 16.1%, 14.4%, 10%, 6.7%), Singapore là 19F, 23F, 14, 6B (tỷ lệ tương ứng 31.1%, 22.3%, 17.9%, 12.85%), hay như ở Thái Lan là 6B, 23F, 19F, 14 (19%, 17.3%, 11.5%, 9.8%) [151]. Typ 9V chỉ có ở Hàn Quốc và typ 18C ở Hồng Kông. Typ huyết thanh 4 ít phổ biến ở các quốc gia khu vực châu Á. Sự khác biệt về tỷ lệ phân bố chủng vi khuẩn mang các serotype nổi trội ở các quốc gia đã phản ánh mức độ bao phủ của vắc xin đối với các typ huyết thanh. Trước khi PCV7 được sử dụng, mức độ bao phủ các serotype của PCV7 ở Hồng Kông, Singapore và Đài Loan lớn hơn 80%; Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan từ 80% đến 60%, và Trung Quốc dưới 60%. Một công bố khác tổng hợp từ 85 nghiên cứu tại Trung Quốc trên tổng số 16.945 chủng phế cầu, cho kết quả tương đồng về các typ huyết thanh phổ biến ở trẻ trong giai đoạn từ năm 2000-2016 là 19F, 19A, 23F, 14 và 6B [27]. Tại Trung Quốc, vắc xin cộng hợp PCV13 mới được cấp phép sử dụng từ
19F 28.1% 6A/B 25.4% 23F 13% 11 7.6% 14 9.7% 15B/C 19A(3%) 17F 23A 10A 34 3 18 0.3% NT 10% 19F 6A/B 23F 11 14 15B/C 19A 17F 23A 10A 34 3 18 NT
năm 2017 nhưng tỷ lệ được tiêm phòng cũng như tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh phế cầu thấp. Vắc xin PCV10, PCV13 chỉ bao phủ 29,7% và 49,5% cáp typ huyết thanh lưu hành tại Trung Quốc [27]. Tại khu vực Tây Australia, trước khi vắc xin phế cầu PCV7 được đưa vào chương trình tiêm chủng thường quy thì 73% số ca mắc các bệnh IPD ở trẻ nhỏ dưới 5 tuổi là do các typ huyết thanh 6, 14, 19, 23 gây nên [91].
Vỏ polysaccharide của Streptococcus pneumoniae ức chế khả năng giết của đại thực bào bởi hệ thống miễn dịch tự nhiên. Một số các typ huyết thanh liên quan đến các bệnh xâm lấn, trong khi một số khác chỉ cư trú lành tính ở mũi họng. Sự xâm lấn của typ huyết thanh phế cầu có thể được giải thích bởi khả năng ức chế gắn bổ thể (C3b) trên bề mặt tế bào vi khuẩn và gây opsonin hóa đại thực bào (opsonophagocytic killing) [99]. Sự phân bố các typ huyết thanh của S. pnemioniae có liên quan mật thiết với viêm phổi xâm lấn do phế cầu theo các vùng địa lý khác nhau, việc xác định các typ huyết thanh của các chủng phế cầu gây bệnh sẽ giúp đánh giá hiệu quả của các loại vắc xin phế cầu [79]. Các typ huyết thanh chiếm ưu thế gây bệnh khác nhau giữa các nhóm tuổi, quốc gia và thay đổi theo thời gian. Ở trẻ nhỏ và những cơ thể bị tổn thương hệ miễn dịch, những typ huyết thanh có tính sinh miễn dịch thấp chiếm ưu thế, như là 6, 14, 19, 23. Những typ huyết thanh có tính xâm lấn cao như là 1, 5 và 7 có xu hướng gây bệnh ở những người khỏe mạnh. Bảy kiểu typ huyết thanh (1, 5, 6A, 6B, 14, 19F và 23F) là phổ biến nhất chiếm 58%-66% các bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở các quốc gia. Các serotype này là nguyên nhân gây nên trên 300.000 ca tử vong ở Châu Phi và 200.000 ca tử vong ở châu Á [79]. Nghiên cứu đã phát hiện 5/7 kiểu typ huyết thanh thuộc nhóm này (6A, 6B, 14, 19F và 23F) và chiếm tới 76,2 % trong tổng số 331 chủng phân lập được.
Trong nghiên cứu này, có 33 chủng (10%) khơng xác định được typ huyết thanh thuộc nhóm các kiểu typ huyết thanh không nổi trội. Bao gồm 17 chủng của Khánh Hoà, 11 chủng của Hải Dương và 5 chủng của Bạch Mai. Có 5 kiểu typ huyết thanh được bao phủ trong vắc xin PCV7 và PCV10 là 19F, 6B, 23F, 14 và 18, trong đó có 4 kiểu typ chiếm ưu thế. Số lượng chủng đồng nhiễm từ 2-3 typ huyết thanh là 23, chiếm tỷ lệ 6,9%. Tỷ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh khác nhau ở các khu vực, cao nhất là BVĐK Bạch Mai (10%) sau đó là BVĐK Khánh Hồ (6,5%) và BVĐK Hải Dương (3,9%).
Trong số 33 chủng không định typ huyết thanh có 21 chủng dương tính với gen
cpsA và 12 chủng âm tính. 12 chủng âm tính với cpsA này cũng là tồn bộ số chủng có cpsA(-) và lytA(+) được khẳng định bằng PCR để đưa vào nghiên cứu (mục 3.1.2) và điều
này cho thấy tất cả các chủng không mang cpsA đều không xác định được typ huyết
thanh. Gen cpsA thuộc bốn gen đầu tiên ở đầu 5’ của locus cps (cpsA-D). Các kháng
nguyên vỏ của vi khuẩn S. pneumoniae được tạo ra bởi tổ hợp các gen nằm trên cùng một vị trí locus cps của nhiễm sắc thể. Trình tự nucleotid của locus cps ở các chủng khác nhau tương ứng với trên 90 typ huyết thanh của phế cầu. Cơ sở lý luận này cho thấy khả năng 12 chủng này thuộc nhóm phế cầu khơng có vỏ nên khơng xác định được typ huyết thanh. Chủng phế cầu có vỏ thường liên quan đến độc lực và khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Các trường hợp này rất có khả năng phế cầu khơng phải là căn ngun chính gây bệnh, mà do tác nhân đồng nhiễm khác. Theo kết quả ở Hình 3.1. ở trên, có 14,7% số chủng của bệnh nhi khu vực Khánh Hòa đồng nhiễm S. pneumoniae và H.influenzae, tỷ lệ này tương ứng ở Hải Dương và Bạch Mai là 10,8% và 12,6%. Vi khuẩn S. pneumoniae và H.influenzae thường là căn nguyên gây nên cùng một số bệnh đường hô hấp. Trong số 33
chủng S. pneumoniae không định được typ huyết thanh có 21 chủng mang gen cpsA
chiếm tỷ lệ 6,34%. Con số 6,34% có thể mới là tỷ lệ các typ huyết thanh không định typ thực sự của nghiên cứu. Số chủng này có thể thuộc nhóm các typ huyết thanh hiếm gặp hoặc chưa bao gồm trong 40 typ huyết thanh kể trên.
3.3.2. Kết quả phân bố typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae theo khu vực.
So sánh các kiểu typ huyết thanh khác nhau ở các khu vực nghiên cứu. Khánh Hồ có 9 kiểu typ huyết thanh (19F, 6A/B, 23F, 11, 14, 15B/C, 17F, 23A, và 34) khơng có typ 19A, 10A, 3 và 18 (Hình 3.10). Hải Dương có 9 kiểu typ huyết thanh (19F, 6A/B, 23F, 11, 14, 15B/C, 19A, 34 và 3), khơng có typ 17F, 23A, 10A và 18 (Hình 3.11). Bạch Mai có 11 kiểu typ huyết thanh (19F, 6A/B, 23F, 11, 14, 15B/C, 19A, 23A, 10A, 3 và 18) khơng có typ 17F và 34 (Hình 3.12).
Hình 3.10. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Khánh Hịa
Hình 3.11. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Hải Dương
Hình 3.12. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Bạch Mai
Các kiểu typ huyết thanh nổi trội không khác nhau ở các khu vực, tuy nhiên tỷ lệ phân bố các typ này khác nhau. Trong khi tỷ lệ mang typ 19 cao hơn hẳn các typ còn lại ở
0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 19 F 6A /B 23F 11 14 15 B/ C 19 A 17 F 23 A 10 A 34 3 18 26.0% 29.9% 12.3% 5.8%8.4%5.8% 0.0%3.9% 2.6% 0.0% 0.6% 0.0% 0.0% Khánh Hòa 0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 22.1%20.8%