CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4.2. Kỹ thuật định typ huyết thanh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
1.4.2.1. Thử nghiệm “Quellung”
Phản ứng Quellung dương tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu typ huyết thanh (type-specific antiserum) gắn với thành phần polysaccharide của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dưới dạng "phình vỏ". Hình ảnh quan sát cho thấy tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh tế bào có một quầng với đường viền sắc nét, đó là gờ ngồi của vỏ (do ánh sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu). Các vi khuẩn hoặc ở dạng đơn, nối đôi hoặc chuỗi ngắn đều có thể có phản ứng Quellung. Bằng thử nghiệm này, phế cầu khuẩn có thể được xác định trực tiếp từ các dịch cơ thể (dịch não tuỷ, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí quản hoặc đờm) hay từ 1 khuẩn lạc đơn.
Tuy nhiên, phản ứng chỉ xảy ra khi có sự tương quan về lượng giữa kháng nguyên (vi khuẩn) và kháng thể (kháng huyết thanh), do đó để tránh âm tính giả do dư thừa kháng nguyên, nên chuẩn bị các phiến kính sao cho mỗi một vi trường chỉ chứa từ 50 - 100 tế bào, lượng tế bào tối ưu nhất để quan sát là 25 - 50 tế bào vi khuẩn trong một vi trường.
1.4.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi xác định đồng thời nhiều typ huyết thanh
Nuôi cấy vi khuẩn và huyết thanh học vẫn là tiêu chuẩn vàng cho định typ huyết thanh của phế cầu nhưng chi phí cao, tốn cơng sức và có độ nhạy thấp, đặc biệt khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi lấy mẫu. Các phương pháp sinh học phân tử dựa trên cơ sở PCR đã được nghiên cứu phát triển để khắc phục nhược điểm của các kỹ thuật truyền thống nhằm mục đích định danh và định lượng vi khuẩn S. pneumoniae. Việc xác
định đúng và chính xác typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae có ý nghĩa quan
trọng trong việc xác định vắc xin và đánh giá tỷ lệ bao phủ hay hiệu quả của vắc xin phế cầu, đặc biệt là trên các trẻ nhỏ dưới 5 tuổi do những trẻ này thường mắc các bệnh viêm đường hô hấp cấp mà nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn S. pneumoniae. Trong vài năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cho chẩn đoán typ huyết thanh của S. pneumoniae như kỹ thuật PCR đa mồi, kỹ thuật real - time PCR. Ưu điểm của các phương pháp này là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thơng thường [10]. Ngày nay, trình tự nucleotide của locus cps tương ứng với hơn 90 typ huyết thanh của vi khuẩn phế cầu đã được xác định và là cơ sở cho việc phân loại vi khuẩn S. pneumoniae dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử [13]. Trình tự mồi, cũng như quy trình được áp dụng theo hướng dẫn của CDC nhưng có cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
Hình 1.12. PCR đa mồi xác định typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae [26].
Phản ứng PCR 1 Phản ứng PCR 2 Phản ứng PCR 3
Phản ứng PCR 4 Phản ứng PCR 5 Phản ứng PCR 6
1.4.2.3. Kỹ thuật nanofruidic xác định đồng thời nhiều typ huyết thanh
Nanofluidic dựa trên nguyên lý kỹ thuật real-time PCR, đáp ứng tất cả các đặc tính của real-time PCR như độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, tính hiệu quả, độ lặp, khả năng tái lặp. Bên cạnh đó ưu điểm của nanofluidic so với PCR đa mồi là cung cấp số liệu định lượng và cịn định typ được cả nhóm nhỏ các typ huyết thanh phụ. Việc thu thập dữ liệu định lượng rất quan trọng vì tải lượng phế cầu khuẩn vùng hầu họng có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của viêm phổi và tử vong, cả ở trẻ em và người lớn; kỹ thuật này cũng được áp dụng cho dự đoán bệnh viêm phổi [34].
1.4.2.4. Lựa chọn kỹ thuật cho nghiên cứu xác định typ huyết thanh
Trong thử nghiệm Quellung, phế cầu khuẩn được xác định với một bộ kháng huyết thanh, bao gồm tập hợp của 90 loại kháng thể đặc hiệu tương ứng với 90 loại phế cầu khuẩn có cấu trúc vỏ khác nhau cịn gọi là kháng huyết thanh đa giá hoặc tập hợp của một số kháng thể đặc hiệu lồi hay nhóm và trong mỗi tập hợp có 4 - 7 loại kháng huyết thanh đơn giá (58 loại trong tổng số 90 thuộc về 20 nhóm kháng huyết thanh mà mỗi nhóm bao gồm từ 2 - 4 loại). Hiện nay người ta đã biết rõ 46 nhóm phế cầu khuẩn khác nhau và hơn 90% các chủng phế cầu phân lập được từ máu hay dịch não tuỷ đều thuộc về 1 trong 23 nhóm phế cầu đã được chọn để sản xuất vắc xin phịng bệnh do phế cầu. Vì vậy, tại một số phịng thí nghiệm người ta thường dùng 12 nhóm kháng huyết thanh để xác định nhóm các chủng phế cầu phân lập được từ máu và dịch não tuỷ. Khi xác định typ huyết thanh hay thực hiện thử nghiệm Quellung nên tuân theo hướng dẫn của hãng sản xuất và theo mục đích dịch tễ học để chọn kháng huyết thanh. Có thể có mặt các kháng thể gây phản ứng chéo trong huyết thanh cùng nhóm nên phải có sự kiểm tra hình thái học của khuẩn lạc và vi khuẩn cũng như tính bắt màu Gram của các chủng được thử nghiệm. Nhược điểm của phương pháp này là rất tốn kém, mất nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng chéo giữa các kháng huyết thanh và có tỷ lệ phát hiện vi khuẩn thấp, đặc biệt khi trẻ sử dụng kháng sinh trước đó. Ngồi ra, phương pháp ni cấy kinh điển khó phát hiện các trường hợp đồng nhiễm nhiều typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae, là
phòng phế cầu. Đặc biệt kỹ thuật này phụ thuộc nhiều vào kỹ năng cũng như nhận định chủ quan của người thực hiện.
Các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR đa mồi và real-time PCR) đã tăng đáng kể độ nhạy của chẩn đoán bệnh phế cầu ngay cả trong trường hợp ni cấy âm tính và xác định được phế cầu khuẩn vùng hầu họng. Tuy nhiên do hiệu quả về chi phí, hầu hết các quy trình multiplex PCR định typ sử dụng các cặp mồi khác nhau chỉ để xác định một số typ huyết thanh đích phổ biến phục vụ cho các nghiên cứu về dịch tễ. Real-time PCR có độ nhạy cao hơn PCR đa mồi và được sử dụng trong chẩn đoán mẫu lâm sàng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi bởi những ưu việt là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thông thường [10].
Chúng tôi đã áp dụng quy trình của CDC để xây dựng quy trình của phịng thí nghiệm trong chương trình giám sát của mình. Sử dụng 36 cặp mồi được phân chia thành tám phản ứng PCR đa mồi. Các phản ứng được thiết kế tuần tự bao gồm các typ huyết thanh thường gặp nhất. Việc thiết kế lại các tổ hợp mồi và thứ tự thực hiện các nhóm phản ứng dựa trên số liệu các typ huyết thanh phổ biến đã công bố ở Việt Nam đã làm giảm đáng kể hiệu quả về chi phí và tiết kiệm thời gian. Đây được xem là một bước cải tiến cũng như điểm mới của luận án.