2.2.8.4. Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh
a/ Các mồi (primers)
Các mồi được sử dụng để xác định typ huyết thanh phế cầu được tham khảo của CDC.
Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định typ huyết thanh phế cầu [26]
Mồi Trình tự Nồng độ cuối
(µM)
Kích thước (bp)
Nhóm phản ứng PCR 1
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC 14-F GAA ATG TTA CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT
0,3 189
14-R GCC AAT ACT TCT TAG TCT CTC AGA TGA AT 6-F AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT ATC TGG
0,3 250
6-R TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA 19F-F GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT ATC C
0,3 304
19F-R GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG 23F-F
Mồi Trình tự Nồng độ cuối (µM)
Kích thước (bp)
23F-R CAC AAC ACC TAA CAC ACG ATG GCT ATA TGA TTC 11-F GGA CAT GTT CAG GTG ATT TCC CAA TAT AGT G
0,5 463
11-R GAT TAT GAG TGT AAT TTA TTC CAA CTT CTC CC
Nhóm phản ứng PCR 2
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
10F/C/33C-F
GGA GTT TAT CGG TAG TGC TCA TTT TAG CA
1 248
10F/C/33C-R
CTA ACA AAT TCG CAA CAC GAG GCA ACA 34-F
GCT TTT GTA AGA GGA GAT TAT TTT CAC CCA AC
0,2 408
34-R
CAA TCC GAC TAA GTC TTC AGT AAA AAA CTT TAC 15B/C-F
TTG GAA TTT TTT AAT TAG TGG CTT ACC TA
0,3 496
15B/C-R
CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC C 19A-F
GTT AGT CCT GTT TTA GAT TTA TTT GGT GAT GT
0,5 566
19A-R
GAG CAG TCA ATA AGA TGA GAC GAT AGT TAG
Nhóm phản ứng PCR 3
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
1-F
CTC TAT AGA ATG GAG TAT ATA AAC TAT GGT TA
0,7 280
1-R
CCA AAG AAA ATA CTA ACA TTA TCA CAA TAT TGG C 5-F
ATA CCT ACA CAA CTT CTG ATT ATG CCT TTG TG
0.7 362
5-R
GCT CGA TAA ACA TAA TCA ATA TTT GAA AAA GTA TG 4-F
CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G
0,3 430
4-R
GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G 18-F
CTT AAT AGC TCT CAT TAT TCT TTT TTT AAG CC
0,5 573
18-R
TTA TCT GTA AAC CAT ATC AGC ATC TGA AAC 17F-F
TTC GTG ATG ATA ATT CCA ATG ATC AAA CAA GAG
1 693
17F-R
GAT GTA ACA AAT TTG TAG CGA CTA AGG TCT GC
Nhóm phản ứng PCR 4
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
7B/C-F
CTA TCT CAG TCA TCT ATT GTT AAA GTT TAC GAC GGG A 0,2 260 7B/C-R
GAA CAT AGA TGT TGA GAC ATC TTT TGT AAT TTC 3-F
ATG GTG TGA TTT CTC CTA GAT TGG AAA GTA G
0,2 371
3-R
CTT CTC CAA TTG CTT ACC AAG TGC AAT AAC G 9N/L-F
GAA CTG AAT AAG TCA GAT TTA ATC AGC 0,2 516 9N/L-R
ACC AAG ATC TGA CGG GCT AAT CAA T 10A-F
GGT GTA GAT TTA CCA TTA GTG TCG GCA GAC
0,3 628
10A-R
GAA TTT CTT CTT TAA GAT TCG GAT ATT TCT C 9V/A-F
Mồi Trình tự Nồng độ cuối (µM)
Kích thước (bp)
9V/A-R
CCA TGA ATG AAA TCA ACA TTG TCA GTA GC
Nhóm phản ứng PCR 5
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
35A/C-F
ATT ACG ACT CCT TAT GTG ACG CGC ATA
0,2 280
35A/C-R
CCA ATC CCA AGA TAT ATG CAA CTA GGT T 12-F
GCA ACA AAC GGC GTG AAA GTA GTT G 0,3 376 12-R
CAA GAT GAA TAT CAC TAC CAA TAA CAA AAC 22A/F-F
GAG TAT AGC CAG ATT ATG GCA GTT TTA TTG TC
0,3 643
22A/F-R
CTC CAG CAC TTG CGC TGG AAA CAA CAG ACA AC 23A-F
TAT TCT AGC AAG TGA CGA AGA TGC G
1 722
23A-R
CCA ACA TGC TTA AAA ACG CTG CTT TAC
Nhóm phản ứng PCR 6
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
21-F
CTA TGG TTA TTT CAA CTC AAT CGT CAC C
0,2 192
21-R
GGC AAA CTC AGA CAT AGT ATA GCA TAG 33F-F
GAA GGC AAT CAA TGT GAT TGT GTC GCG
0,3 338
33F-R
CTT CAA AAT GAA GAT TAT AGT ACC CTT CTA C 20-F
GAG CAA GAG TTT TTC ACC TGA CAG CGA GAA G
0,5 514
20-R
CTA AAT TCC TGT AAT TTA GCT AAA ACT CTT ATC 35B-F
GAT AAG TCT GTT GTG GAG ACT TAA AAA GAA TG
1,2 617
35B-R
CTT TCC AGA TAA TTA CAG GTA TTC CTG AAG CAA G
Nhóm phản ứng PCR 7
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
0,1 160
CPSA-R GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC
39-F
TCA TTG TAT TAA CCC TAT GCT TTA TTG GTG
0,4 98
39-R
GAG TAT CTC CAT TGT ATT GAA ATC TAC CAA 23B-F
CCA CAA TTA GCG CTA TAT TCA TTC AAT CG
0,1 199
23B-R
GTC CAC GCT GAA TAA AAT GAA GCT CCG 2-F
TAT CCC AGT TCA ATA TTT CTC CAC TAC ACC
0,5 290
2-R
ACA CAA AAT ATA GGC AGA GAG AGA CTA CT 35F/47F-F
GAA CAT AGT CGC TAT TGT ATT TTA TTT AAA GCA A
0,7 517
35F/47F-R
GAC TAG GAG CAT TAT TCC TAG AGC GAG TAA ACC 13-F
TAC TAA GGT AAT CTC TGG AAA TCG AAA GG
0,5 655
13-R
CTC ATG CAT TTT ATT AAC CGC TTT TTG TTC
Nhóm phản ứng PCR 8
CPSA-F GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC
Mồi Trình tự Nồng độ cuối (µM)
Kích thước (bp)
24-F
GCT CCC TGC TAT TGT AAT CTT TAA AGA G
0,4 99
24-R
GTG TCT TTT ATT GAC TTT ATC ATA GGT CGG 8-F
GAA GAA ACG AAA CTG TCA GAG CAT TTA CAT
0,3 201
8-R
CTA TAG ATA CTA GTA GAG CTG TTC TAG TCT 42F-F
ATT ACG ACT CCT TAT GTG ACG CGC ATA
0,3 280
42F-R
CCA ATC CCA AGA TAT ATG CAA CTA GGT T 38/25F-F
CGT TCT TTT ATC TCA CTG TAT AGT ATC TTT ATG
0,1 574
38/25F-R
ATG TTT GAA TTA AAG CTA ACG TAA CAA TCC 15A/F-F ATT AGT ACA GCT GCT GGA ATA TCT CTT C
0,5 434
15A/F-R GAT CTA GTG AAC GTA CTA TTC CAA AC
b/ Áp dụng và cải tiến quy trình kỹ thuật PCR đa mồi xác định typ huyết thanh
Kỹ thuật định typ huyết thanh được sử dụng là PCR đa mồi, cho phép phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh của S. pneumoniae. Sự có mặt hoặc tình trạng biến đổi
trình tự sắp xếp của các gen đặc hiệu cấu trúc của lớp polysaccharide vỏ là cơ sở để xác định typ huyết thanh của phế cầu. Tồn bộ chu trình nhiệt, mồi, thành phần phản ứng đều áp dụng phương pháp đã công bố của CDC [26]. Tuy nhiên, do sự khác biệt về sự phân bố các typ huyết thanh ưu thế của vi khuẩn S. pneumoniae lưu hành giữa các quốc gia,
cần phải sắp xếp lại trình tự cũng như tổ hợp các nhóm phản ứng khác nhau để tránh lãng phí nguồn lực, chi phí và thời gian. Quy trình xét nghiệm của chúng tơi bên cạnh áp dụng quy trình, đã tiến hành tối ưu hố nhóm các mồi ở mỗi phản ứng PCR nhằm tăng hiệu quả của quy trình. Phương pháp PCR đa mồi giúp xác định được 40 typ huyết thanh của phế cầu tương ứng với 36 cặp mồi khác nhau, được chia thành 8 nhóm phản ứng. Bảng 2.6. trình bày cách sắp xếp các nhóm phản ứng PCR để xác định typ huyết thanh trong quy trình của CDC áp dụng ở một số khu vực khác nhau và so với nghiên cứu này.
Các typ huyết thanh sử dụng làm chứng dương được tách chiết từ các chủng
S.pneumoniae do CDC cung cấp được kiểm tra đối chiếu với kỹ thuật phồng vỏ Quellung
tại phịng thí nghiệm của trường đại học Nagasaki-Nhật Bản. Sử dụng kít tách chiết để đảm bảo thu được ADN tinh sạch nhất (quy trình được trình bày ở ý a/ mục 2.2.8.2). ADN sau khi tinh sạch, được đo nồng độ bằng máy đo quang phổ. Biết được giá trị nồng
độ để chộn tỷ lệ các ADN mang các typ huyết thanh của các nhóm phản ứng theo bảng 2.7 để làm chứng dương cho kỹ thuật PCR đa mồi.
Tiêu chí lựa chọn mồi cho 8 nhóm phản ứng PCR: 1/Các typ phổ biến tham khảo từ các nghiên cứu đã công bố trong khu vực được đưa lên các nhóm phản ứng PCR đầu. 2/Kích thước của mồi phải cách xa nhau tối thiểu là 50 bp trong cùng nhóm phản ứng; 3/Sử dụng phần mềm để kiểm tra tương tác mồi và các sản phẩm điện di sau khi thực hiện phản ứng PCR.
Bảng 2.6. Tổ hợp các mồi của quy trình PCR xác định typ huyết thanh áp dụng ở các khu vực khác nhau [26] Nhóm phản ứng PCR Tổ hợp mồi áp dụng ở Mỹ Tổ hợp mồi được áp dụng ở Mỹ - Latinh Tổ hợp mồi được áp dụng ở Châu Phi Tổ hợp mồi được tối ưu
hoá 1 6A/6B/6C/6D, 3, 19A, 22F/22A, 16F 14, 6A/6B/6C/6D, 23F, 19A, 9V/9A 14, 1, 5, 4, 18A/18B/18C/18F CPSA, 14, 6A/6B, 19F, 23F, 11 2 8, 33F/33A/37,
15A/15F, 7F/7A, 23A
19F, 3, 15B/15C, 18A/18B/18C/18F, 17F 6A/6B/6C/6D, 19F, 23F, 38/25F, 9V/9A 10F/C/33C, 34, 15B/C, 19A 3 19F, 12F/12A/44/46, 11A/11D, 38, 35B 1, 5, 9L/9N, 7F/7A, 16F 7C/7B/40, 3, 15B/15C, 7F/7A, 17F 1, 5, 4, 18, 17 4 24A/24B/24F, 7C/7B/40, 4, 18A/18B/18C/18F, 9V/9A 8, 2, 4, 20, 22F/22A 8, 12F/12A/44/46, 9L/9N, 22F/22A, 23A 7B/C, 3, 9N/L, 10A, 9V/A 5 14, 1, 23F, 15B/15C, 10A 7C/7B/40, 12F/12A/44/46, 11A/11D, 10A, 23A
24A/24B/24F, 2, 11A/11D, 19A, 16F 35A/C, 12, 22A/F, 23A 6 39, 10F/10C/33C, 5, 35F/47F, 17F 21, 33F/33A/37, 15A/15F, 35F/47F, 13 21, 33F/33A/37, 15A/15F, 35F/47F, 13 21, 33F, 20, 35B 7 23B, 35A/35C/42, 34, 9N/9L, 31 39, 23B, 35A/35C/42, 38/25F/25A, 35B 39, 23B, 35A/35C/42, 20, 35B 39, 23B, 2, 35F/47F, 13 8 6A/6B/6C/6D, 6C/6D 24A/24B/24F, 10F/10C/33C, 34, 31 10F/10C/33C, 34, 10A, 31 24, 8, 38/25F, 15A/F, 42F
Quy trình PCR sau khi được tối ưu hố về tổ hợp các nhóm mồi xác định nhóm các typ huyết thanh khác nhau được áp dụng để xác định typ huyết thanh cho các chủng
S.pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm.
c/ Các bước tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi xác định typ huyết thanh
- Phương pháp PCR đa mồi được chia thành 8 phản ứng PCR đa mồi với các tổ hợp mồi khác nhau, sử dụng sinh phẩm PCR của Promega (Mỹ). Tám nhóm phản ứng PCR với 8 tổ hợp mồi khác nhau được tóm tắt trong Bảng 2.7.
- Các nhóm phản ứng lần lượt được thực hiện ở các nồng độ phối trộn mồi khác nhau cùng với nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+, và điều kiện phản ứng cho tất cả các nhóm để đạt được sự biểu hiện đồng thời của tất cả các typ huyết thanh có trong một mẫu chứng dương chứa hỗn hợp các typ huyết thanh tách chiết từ chủng chuẩn do CDC cung cấp. Tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 25µl với các cặp mồi có trình tự, kích thước sản phẩm cũng như nồng độ cuối sử dụng theo 8 nhóm phản ứng sau khi được tối ưu hóa. Các typ huyết thanh phổ biến được sắp xếp ở các nhóm đầu tiên để giảm thiểu số lần xét nghiệm, các nhóm sau là các typ hiếm gặp.
- Kết quả của phản ứng PCR đa mồi được kiểm tra bằng phương pháp điện di sản phẩm phản ứng trên thạch agarose 2% (1 Nusieve : 1 Seakem) có bổ sung thuốc nhuộm ADN là Redsafe (theo tỷ lệ thuốc nhuộm : thể tích thạch là 1:20.000).
Bảng 2.7. Bảng ký hiệu các mồi được sử dụng trong các nhóm phản ứng
Nhóm phản ứng Các mồi sử dụng
Nhóm 1 CPSA, 14, 6A/6B, 19F, 23F, 11 Nhóm 2 10F/C/33C, 34, 15B/C, 19A
Nhóm 3 1, 5, 4, 18, 17
Nhóm 4 7B/C, 3, 9N/L, 10A, 9V/A
Nhóm 5 35A/C, 12, 22A/F, 23A
Nhóm 6 21, 33F, 20, 35B
Nhóm 7 39, 23B, 2, 35F/47F, 13 Nhóm 8 24, 8, 38/25F, 15A/F, 42F
Chu trình nhiệt:
94oC 94oC 55oC 72oC 72oC 4oC 3 phút 45 giây 45 giây 60 giây 10 phút
35 chu kỳ
- Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR thermal cycler (ABI, Mỹ). Sản phẩm PCR được điện di trên trên gel 2% (1% Agarose, 1% Nusieve), nhuộm bằng RedSafeTM
trong mơi trường đệm TAE 1X, 120V, dịng 200mA, 35 phút và chụp ảnh bằng máy chụp gel.
2.2.8.5. Kỹ thuật PCR phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh
a/ Thông tin về mồi
Bảng 2.8. Thông tin về mồi phát hiện các kiểu gen kháng kháng sinh của S. pneumoniae [110]
Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích
thước Gen mã hóa
PCR 1
1 lytA-681F CAA CCG TAC AGA ATG AAG CGG
319bp Autolysine
lytA-999R TTA TTC GTG CAA TAC TCG TGC G 2 Pbp1A-2037F AAA CCG CGA CTG GGG ATC AAC
238 bp
Penicillin binding protein 1A
Pbp1A-2275R GGT TGA GCT CGA CCT TGT TT 3 Pbp2X-1255F CCA GGT TCC ACT ATG AAA GTG
197bp
Penicillin binding protein 2X
Pbp2X-1451R ATC CCA ACG TTA CTT GCG TGT 4 Pbp2B-1566F CCT ATA TGG TCC AAA CAG CCT
147 bp Penicillin binding protein 2B Pbp2B-1693R GGT CAA TTC CTG TCG CAG TA PCR 2
4 MefA-180F CTG TAT GGA GCT ACC TGT CTG G
293 bp MefA MefA-180F CCC AGC TTA GGT ATA CGT AC
5 ErmB-721F CGT ACC TTG GAT ATT CAC CG
224 bp ErmB ErmB-944R GTA AAC AGT TGA CGA TAT TCT CG
b/ Áp dụng và tối ưu hoá quy trình
Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae (chủ yếu là β-
lactam và macrolide) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối với các protein gắn penicillin (chủ yếu là pbp1a, pbp2x, pbp2b) hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích
(methyl hóa ribosom) do gen ermB (gây kháng đồng thời nhiều dòng kháng sinh của
macrolides, clindamycine và tetracycline) hoặc hoặc hình thành các bơm sinh học nằm ngang với màng tế bào vi khuẩn giúp đẩy kháng sinh nhóm macrolide ra ngồi ngay khi kháng sinh vừa xâm nhập, được quy định thông tin di truyền bởi gen nhảy mefA [21].
Nghiên cứu áp dụng quy trình của Nagai và cộng sự năm 2001. Tuy nhiên có cải tiến về việc kết hợp các mồi cho phản ứng. Quy trình của Nagai bao gồm 3 phản ứng với 6 cặp mồi: phản ứng PCR1 (lytA và pbp1A), phản ứng PCR2 (pbp2X và pbp2B) và phản
ứng PCR3 (mefA và ermB) [110]. Dựa trên kích thước và nhiệt độ gắn mồi, chúng tơi đã kết hợp phản ứng 1 và 2 lại thành 1 phản ứng. Các nhóm phản ứng được thể hiện trong Bảng 2.9. Quy trình sau khi được tối ưu trên các chủng chứng dương được thực hiện trên các chủng S. pneumoniae phân lập từ bệnh phẩm.
Bảng 2.9. Bảng so sánh tối ưu hố nhóm phản ứng PCR xác định gen kháng kháng sinh [110]
Nhóm phản ứng PCR
Quy trình trong nghiên cứu của Nagai Quy trình được tối ưu hố
1 lytA pbp1A 319bp 238 bp lytA pbp1A pbp2X pbp2B 319bp 238 bp 2 pbp2X pbp2B 197bp 147 bp 197bp 147 bp 3 mefA