Sơ đồ chấm huyền dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường- 123docz.net

e/ Đọc kết quả:

- Điều kiện đọc kết quả: chủng vi khuẩn phải phát triển tốt trong giếng chứng âm. Kết quả MIC ở các chủng chuẩn quốc tế phải nằm trong giới hạn cho phép.

- Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả MIC của các chủng được so sánh với nồng độ giới hạn trong bảng CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2016 [30] và EUCAST (European Committee Antomicrobial Susceptibility testing) 2014 [41].

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1. Đặc điểm phân lập của đối tượng nghiên cứu

Trong số 1012 trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do viêm đường hơ hấp cấp tính, phân lập và định danh được 331 chủng vi khuẩn S. pneumoniae với nồng độ vi khuẩn trên

106CFU/ml bệnh phẩm, chiếm tỷ lệ 32,7%. Kết quả được mô tả trong bảng sau: Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn S. pneumoniae từ bệnh phẩm

Số trẻ mắc ARI Tỷ lệ phân lập S.pneumoniae

N(%) N(%) p-value Tuổi < 1 tuổi 377(37,3%) 127(33,7%) 0.1439 1-2 tuổi 302(29,8%) 111(36,8%) 2-3 tuổi 170(16,8%) 49(28,8%) 3-4 tuổi 96(9,5%) 28(29,2%) 4-5 tuổi 67(6,6%) 16(23,9%) Giới Nam 573(56,6%) 193(33,7%) 0.449 Nữ 439(43,4%) 138(31,4%) Khu vực BVĐK Khánh Hòa 394(38,9%) 154(39,1%) 0.0085 BVĐK Hải Dương 297(29,3%) 77(25,9%) BVĐK Bạch Mai 321(31,7%) 100(31,2%) Tổng số 1012 331(32,7%)

Đồng nhiễm S. pneumoniae và H.influenzae 128(12.65%)

Các yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng mắc bệnh viêm đường hô hấp cấp hay viêm phổi xâm lấn ở trẻ em bao gồm các yếu tố thuộc về bệnh nhân. Trẻ dưới hai tuổi, chưa được tiêm chủng, trẻ suy giảm miễn dịch nguyên phát hoặc thứ phát, đồng nhiễm viêm đường hô hấp do vi rút, hoặc đang mắc các căn bệnh khác như tim, thận, tiểu đường… thường có nguy cơ mắc cao hơn. Các yếu tố về tác nhân gây bệnh (loại typ huyết thanh

như những tháng mùa đơng, trẻ có cha mẹ hút thuốc, sống trong môi trường đông đúc, ô nhiễm…đều là các yếu tố làm tăng nguy cơ mắc viêm phổi xâm lấn ở trẻ [2, 37].

Trong số trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do viêm đường hô hấp cấp tính, tỷ lệ phân bố giữa ba khu vực, giữa nam và nữ là tương đương nhau và sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê. Nhưng có sự khác biệt trong sự phân bố độ tuổi. Tỷ lệ trẻ dưới 1 tuổi mắc bệnh nhiều nhất (37,3%) tỷ lệ này giảm dần ở nhóm trẻ lớn hơn, chỉ có 6,6% trẻ có độ tuổi từ 4-5 tuổi mắc ARI. Lý giải cho vấn đề này, các cơ quan chức năng cơ thể của trẻ đều còn rất non yếu và chưa hoàn thiện, dễ dàng bị những ảnh hưởng từ mơi trường bên ngồi. Cấu trúc và chức năng của cơ quan hơ hấp phát triển và hồn thiện theo từng giai đoạn phát triển của trẻ. Ở trẻ dưới một tuổi, đường hô hấp nhỏ hẹp và ngắn, khi bị viêm dễ gây phù nề niêm mạc đường thở nên, viêm dễ dàng lan rộng ra xung quanh. Khi bị viêm phổi, bệnh thường tiến triển rất nhanh và nặng. Ở trẻ dưới 1 tuổi, số lượng phế nang vẫn cịn ít, mỗi khi thở tất cả các phế nang đều hoạt động nhanh, quá trình này nếu tăng cao, lâu dài sẽ khiến trẻ kiệt sức và suy hô hấp nguy hiểm. Khi trẻ lớn hơn, cơ quan hơ hấp hồn thiện dần, khả năng miễn dịch cũng cao hơn, vậy nên khi trẻ trên 5 tuổi, tỷ lệ viêm phổi cũng giảm hẳn, cùng với đó các biến chứng nặng cũng ít gặp hơn.

Nhóm trẻ mắc bệnh được tiến hành lấy mẫu phân lập bằng kỹ thuật nuôi cấy theo thường quy của phịng thí nghiệm. Số lượng vi khuẩn lớn hơn 106CFU/ml bệnh phẩm được coi là căn nguyên gây bệnh. Kết quả nêu ở Bảng 3.1 cho thấy, yếu tố độ tuổi, giới tính khơng ảnh hưởng tới tỷ lệ mắc bệnh ARI do căn nguyên S. pneumoniae so với tác

nhân khác với giá trị p-value lần lượt là 0,1439 (so sánh tỷ lệ giữa các nhóm tuổi) và 0,449 (so sánh tỷ lệ giữa nam và nữ). Tuy nhiên có sự khác biệt về tỷ lệ phân lập

S.pneumoniae giữa các bệnh viện, tỷ lệ này có ý nghĩa thống kế với giá trị p = 0,0085 (so

sánh tỷ lệ giữa các bệnh viện). Số trẻ nhập viện tại bệnh viện đa khoa Khánh Hịa có tỷ lệ phân lập cao nhất là 39,1%, sau đó là BVĐK Bạch Mai (31,2%) và BVĐK Hải Dương (25,9%). Tỷ lệ phân lập được phế cầu khuẩn chung của cả ba khu vực là 32,7%, trong đó tỷ lệ đồng nhiễm S. pneumoniae và H. influenzae là 12,65%.

Hình 3.1. Tỷ lệ phân lập S. pneumoniae và H. influenzae

Tỷ lệ phân lập được H.influenzae cũng cao nhất ở khu vực Khánh Hịa, sau đó là

Bạch Mai và Hải Dương với tỷ lệ tương ứng là 28%, 25,6% và 19,2%. Trong đó tỷ lệ đồng nhiễm cả Streptococcus pneumoniae và Heamophillus influenzae ở ba khu vực

tương ứng là 14,7%, 12,6% và 10,8% (Hình 3.1).

Hai tác nhân chính gây viêm phổi cũng như một số bệnh về đường hơ hấp ở trẻ đó là vi khuẩn là H. influenzae và S. pneumoniae. Hiện nay cả H. influenzae và S. pneumoniae đều đã có thể được phịng ngừa bằng vắc xin. Sau khi vắc xin ngừa H. influenzae typ b

được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng thì tỷ lệ viêm màng não mủ do phế cầu đã tăng vượt trội. S. pneumoniae trở nên là căn nguyên quan trọng nhất gây bệnh viêm

phổi cộng đồng và là căn nguyên quan trọng thứ hai gây viêm màng não mủ sau Neisseria

meningitidis ở người trưởng thành.

3.1.2. Khẳng định vi khuẩn S. pneumoniae bằng PCR

Ba trăm ba mươi mốt chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhi nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính (ARI) nhập viện tại 3 bệnh viện đa khoa Khánh Hòa, Bạch Mai và Hải Dương lưu tại phịng thí nghiệm được khẳng định lại bằng kỹ thuật ni cấy phân lập và bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Trong kỹ thuật này, sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu là lytA (là gen mã hóa enzyme thủy phân autolysin liên kết N-acetyl-muramoyl-L-alanine trong cấu trúc

Sp+Hi 14.7% Sp+Hi 10.8% Sp+Hi 12.6%

5’ của locus cps (cpsA-D) có tính bảo thủ cao ở tất cả các typ huyết thanh phế cầu và là

nhân tố điều hịa phiên mã tổng hợp CPS, có kích thước 160bp). Kết quả cho thấy có 12 chủng âm tính với cpsA (3,4%) và 319 chủng dương tính với cpsA (90,6%), 331 chủng

(100%) dương tính với lytA. Sử dụng 331 chủng S. pneumoniae được khẳng định bằng

nuôi cấy và định danh để xác định typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh.

Hiện nay các xét nghiệm PCR thông thường hay real - time PCR đều đã được phát triển để chẩn đoán phát hiện S. pneumoniae. Các gen đích bao gồm pneumolysin (ply),

autolysin (lytA) và gen bám dính bề mặt phế cầu (psaA) [22]. LytA tổng hợp nên

autolysine là một một enzyme thủy phân liên kết N-acetyl-muramoyl-L-alanine trong cấu trúc peptidoglycan của phế cầu. Hoạt tính tự ly giải của enzyme này dẫn đến sự ly giải tế bào đặc trưng cho sự sinh trưởng của phế cầu trong điều kiện nuôi cấy dày, nhưng đồng thời cũng tham gia vào quá trình sinh trưởng và phân chia của tế bào [14]. Pneumolysin là một protein có trọng lượng khoảng 52kDa, là một yếu tố độc lực mạnh mẽ và có phổ hoạt động rộng. Pneumolysin là chất phá huỷ tế bào nội mô phổi, phá vỡ hàng rào nội mô ngăn cách phế nang và máu dẫn tới các triệu chứng nặng. PsaA là gen mã hố protein bám dính bề mặt phế cầu khuẩn. PsaA là một lipoprotein ngoại bào liên kết màng tế bào. CpsA là 1 trong bốn gen đầu tiên ở đầu 5’ của locus cps (cpsA-D) có tính bảo thủ cao ở tất cả các

typ huyết thanh phế cầu. Tương ứng với 4 gen đó là 4 protein CpsA-D, những protein này đều đóng vai trị quan trọng trong sự biểu hiện của CPS [103]. Trong đó, gen CpsA là

nhân tố điều hòa phiên mã tổng hợp CPS, trong khi protein CpsB, CpsC, CpsD có vai trị điều hòa sự lắp ráp, vận chuyển và gắn CPS lên thành tế bào vi khuẩn thơng qua sự phosphoryl hóa tyrosine của CpsD.

Tuy nhiên, trong một nghiên cứu sử dụng gen đích ply cho chẩn đốn phế cầu đã

cho các kết quả dương tính giả với mẫu đường hô hấp trên [106]. Lý giải cho kết quả dương tính giả này là do gen ply chỉ có thể phát hiện được nhóm các liên cầu tan huyết

alpha chứ không đặc hiệu cho phế cầu khuẩn. Một số các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp khác như Streptococcus mitis hay Streptococcus oralis cũng mang gen ply [106, 150, 161]. Các xét nghiệm phát hiện S. pneumoniae bằng PCR sử dụng đoạn đặc hiệu của gen mã hóa autolysin (lytA) có tính bảo thủ cao, đặc hiệu ở vi khuẩn phế cầu và bên cạnh đó

nó cịn được dùng để phân biệt S. pneumoniae với các liên cầu khác như S. mitis , S. oralis, và S. pseudopneumoniae. Trong nghiên cứu của Messmer và cs. Năm 2004 đã sử

dụng gen lytA, psaA và ply để chẩn đốn S. pneumoniae và so sánh với kỹ thuật ni cấy phân lập sử dụng test thử optochin, tan trong muối mật và thử nghiệm Quellung cho thấy:

ply cho kết quả dương tính giả, psaA có 1 kết quả sai lệch và 100% kết quả chính xác là

sử dụng cặp mồi lytA [100].

3.2. ÁP DỤNG VÀ CẢI TIẾN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT VÀ GEN KHÁNG KHÁNG SINH GEN KHÁNG KHÁNG SINH

3.2.1. Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định typ huyết thanh

Sự khác biệt về phân bố các typ huyết thanh giữa các nghiên cứu cịn có thể do việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán khác nhau giữa các nghiên cứu đó. Phương pháp kinh điển cho chẩn đoán typ huyết thanh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae là phương pháp nuôi cấy kết hợp với phản ứng phồng vỏ Quellung với kháng huyết thanh đặc hiệu. Phương pháp này thường rất tốn kém, mất nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng chéo giữa các kháng huyết thanh và có tỷ lệ phát hiện vi khuẩn thấp, đặc biệt khi trẻ sử dụng kháng sinh trước đó. Ngồi ra, phương pháp ni cấy kinh điển khó phát hiện các trường hợp đồng nhiễm nhiều typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae, là yếu tố góp phần dẫn đến hiện tượng chuyển đảo typ huyết thanh sau sử dụng vắc xin phòng phế cầu. Vài năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cho chẩn đoán typ huyết thanh của S. pneumoniae như kỹ thuật PCR đa mồi, kỹ thuật real - time PCR [10, 11, 19, 128]. Các phương pháp PCR có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thông thường [10]. Tuy nhiên, các kỹ thuật PCR đã công bố thường chỉ phù hợp cho từng khu vực nghiên cứu cụ thể. Độ bao phủ các typ huyết thanh của phế cầu trong các kỹ thuật PCR này vẫn còn hạn chế (chỉ bao gồm dưới 30 typ huyết thanh). Do đó, việc tìm ra một qui trình xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chẩn đoán phần lớn các typ huyết thanh lưu hành của phế cầu ở mỗi khu vực, mỗi quốc gia là vấn đề hết sức cần thiết.

Hình 3.2. Ảnh điện di xác định typ huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi

463 bp 384 bp 304 bp 250 bp 189 bp 160 bp 566 bp 496 bp 408 bp 248 bp 160 bp 693 bp 573 bp 430 bp 362 bp 280 bp 160 bp 617 bp 514 bp 338 bp 192 bp 816 bp 628 bp 516 bp 371 bp 260 bp 160 bp 655 bp 517 bp 290 bp 199 bp 160 bp 98 bp 574 bp 434 bp 280 bp 201 bp 160 bp 99 bp M PC 14 6 19F 23F 11 PC: chứng dương M: Thang ADN chuẩn

M 1 5 4 18 17 PC