Kỹ thuật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định tình trạng kháng kháng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.8.6. Kỹ thuật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định tình trạng kháng kháng

a/ Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một

nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự sinh trưởng của vi khuẩn, và có thể quan sát được bằng mắt thường.

b/ Kháng sinh sử dụng trong kỹ thuật:

Sử dụng 15 loại kháng sinh đại diện cho 8 nhóm kháng sinh (penicillin, cephalosporin, carbapenem, macrolide, lincosamid, phenicol, tetracyclin và quinolon) được lựa chọn dựa trên phác đồ điều trị của Bộ Y tế trong điều trị các bệnh do

Bảng 2.10. Các kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu và ngưỡng đọc kết quả MIC [30]

Kháng sinh Ngưỡng đọc kết quả MIC (µg/mL)

Nhóm Ký hiệu Tên S I R PENICILLINS pcg penicillinG ≤0,06 0,12-1 ≥2 ampc amoxicillin ≤2 4 ≥8 abpc/amp ampicillin ≤0.5 1 ≥2 cav amoxicillin- clavulanate(2:1) ≤2/1 4/2 ≥8/4 CEPHALOSPORIN (Thế hệ II, III, IV)

cxm cefuroxime ≤1 2 ≥4

ctx cefotaxime ≤0.5 1 ≥2

cfpm cefepime ≤1 2 ≥4

CARBAPENEMS ipm imipenem ≤0,12 0,25-0,5 ≥1

MACROLIDES em erythromycin ≤0,25 0,5 ≥1

azm azithromycin ≤0,5 1 ≥2

LINCOSAMIDES cam clarithromycin ≤0,25 0,5 ≥1

cldm chlindamycin ≤0,25 0,5 ≥1

PHENICOLS cp chloramphenicol ≤4 - ≥8

TETRACYCLINES tc tetracycline ≤1 2 ≥4

QUINOLON II cpfx ciprofloxacin ≤0,125 >2

c/ Pha loãng kháng sinh: Dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ

kháng sinh), dung dịch “mẹ” được pha theo cơng thức sau:

Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, để pha 10 ml dung dịch kháng sinh “mẹ” có nồng độ 1600 g/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh:

10 ml x 1600g/ml x 100

Xg kháng sinh = -------------------------------- = 16140,421 g/ml = 0,016140 g/ ml 99,13

Kháng sinh bột được pha với dung mơi thích hợp với từng loại kháng sinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Nhiều loại kháng sinh có thể hồ tan và được pha lỗng

trong nước cất. Một số khác cần phải hoà tan trong các dung mơi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất.

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc cần dùng bằng đệm PBS.

- Từ dung dịch gốc pha loãng bậc 2 đến nồng độ thấp nhất cần dùng theo sơ đồ Hình 2.7.

- Dung dịch kháng sinh “mẹ” sau khi pha được chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản âm 20oC (trừ kháng sinh acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử dụng, chỉ dùng trong 24 giờ. Pha loãng kháng sinh bậc 2 bằng dung dịch đệm PBS từ 1280 µg/ml tới 0,08 µg/ml. Nồng độ cuối cùng pha lỗng 1/10 trong mơi trường nuôi cấy canh thang CAMBH có chứa 5% máu cừu đặt trong khay nhựa 96 giếng.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2ml 1280µg/ml 640µg/ml 320µg/ml 160µg/ml 80µg/ml 40 µg/ml 20 µg/ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 10 µg/ml 5µg/ml 2,5µg/ml 1,25µg/ml 0,63µg/ml 0,32µg/ml 0,16µg/ml 0,08µg/ml Hình 2.7. Sơ đồ pha lỗng kháng sinh bậc 2

1

d/ Các bước tiến hành:

Huyền dịch vi khuẩn non pha trực tiếp từ khuẩn lạc nuôi cấy qua đêm (20 - 24 giờ) trên thạch máu cừu với mật độ vi khuẩn tương đương 0,5 McFarland. Pha huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/ml từ huyền dịch vi khuẩn non. Hút 100µl huyền dịch vi khuẩn vào mỗi giếng (khay của bàn chông bao gồm 32 giếng được đánh số thứ tự Hình 2.8.) chứa mơi trường nuôi cấy đã pha kháng sinh ở các nồng độ khác nhau. Mật độ vi khuẩn trong mỗi giếng đạt 104 vi khuẩn/ml. Sử dụng một giếng khơng có kháng sinh để làm chứng âm

2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

Vi khuẩn bị ức chế Vi khuẩn phát triển

và hai giếng bổ sung chủng chuẩn ATCC49619 làm chứng dương. Nuôi cấy ở 37oC trong 20-24 giờ. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ATCC 1 ATCC 2

Hình 2.8. Sơ đồ chấm huyền dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường thạch máu

e/ Đọc kết quả:

- Điều kiện đọc kết quả: chủng vi khuẩn phải phát triển tốt trong giếng chứng âm. Kết quả MIC ở các chủng chuẩn quốc tế phải nằm trong giới hạn cho phép.

- Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả MIC của các chủng được so sánh với nồng độ giới hạn trong bảng CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2016 [30] và EUCAST (European Committee Antomicrobial Susceptibility testing) 2014 [41].