Với phơng pháp này chúng ta cũng có thể tiến hành định lợng, hàm lợng Phytoncid có trong dợc liệu đợc khi so sánh với chất chuẫn.
Cánh đánh giá kết quả: tuỳ theo mc độ mẫn cảm của vi khuẩn với từng loại thuốc cần thử mà ta chia ra các mức độ sau:
Vi khuẩn rất mẫn cảm với thuốc: đờng kính vòng vô khuẩn sẽ lớn hơn 30mm . Thuốc xẽ có tác dụng rất tốt trong điều trị .
Vi khuẩn ít mẫn cảm với thuốc, đờng kính vòng vô khuẩn khoảng 20-30mm với thuốc này muốn điều trị ta phải tăng liềuđiều trị lên so với liều đang dùng .
Vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc thì xung quanh ống khuẩn xẽ không xuất hiện vòng vi khuẩn .Thuốc này xẽ không đợc dùng trong điều trị .
b) Phơng pháp của giáo s: Đặng Văn Ngữ
Các mẫu dợc liệu cần nghiên cứu đem nghiền nát thành bột rồi nén thành viên bánh trụ cao 0,8cm đờng kính 0,3cm đạt viên vào hộp lồng đã có thạch để tủ lạnh 40C /6h chờ hoạt chất kháng sinh từ khuyếch tán ra ngoài môi trờng. Sau lấy hộp lồng từ tủ lạnh ra, đặt vào chuông thuỷ tinh có chứa các đĩa thạch kể trên. Chuyển thạc đĩa vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau đọc kết quả bằng cách do vòng vô khuẩn xung quanh chân viên nén.
Phơng pháp này tránh đợc việc sử dụng các khâu nhng lại phải dùng những phơng tiện cồng kềnh khác: Máy nghiền dợc liệu, máy nén viên trụ…
Chú ý: Phơng pháp này rất nguy hiểm nhất là khi nghiên cứu những loại vi khuẩn gây bệnh chung giữa gia súc và ngời.
c) Phơng pháp thử các Phytoncid bay hơi với các vi khuẩn hiếu khí:
Có nhiều cách làm, ở đây chúng tôi giới thiệu phơng pháp của giáo s Rudat ng- ời Đức. Phơng pháp này đợc áp dụng phổ biến hơn cả. Cách làm nh sau:
Lấy 2 nữa hộp lồng có đờng kính bằng nhau. Nửa trên của hộp lồng ta đổ thạch và cấy vi khuẩn cần thử. Nửa dới hộp lồng ta đặt chất thuốc là những Phytoncid bay hơi (dợc liệu giã nhỏ, tinh dầu nguyên chất, bông tẩm nớc cốt của dợc liệu…).Gắn parafin đặt tủ ẩm 37oC/12 giờ đọc kết quả. Nếu kháng sinh bay hơi này có khả năng ức chế vi khuẩn thí nghiệm, thì nửa trên của hộp lồng, vi khuẩn không mọc, hay mọc rất ít so với đối chứng.
d) Phơng pháp thử Phytoncid với vi khuẩn kỵ khí
Phơng pháp này đợc áp dụng chủ yếu ở các cơ sở nghiên cứu: Cục, Viện và Tr- ờng của Trung ơng để đảm bảo tính chất an toàn khi nghiên cứu một dợc liệu nào đó, còn ở các cơ sở sản xuất: các Chi cục Thú y và trại chăn nuôi tập thể… hiện nay cha áp dụng.
Trớc khi tiến hành Phơng pháp nay, ta phải loại bỏ hết tạp chất gồm: tanin, gôm, protein của dợc liệu. Rồi bằng Phơng pháp làm lạnh, để lấy hết không khí trong môi trờng nuôi cấy đi. Cho dợc liệu thí nghiệm. Với các nồng độ khác nhau vào môi trờng nuôi cấy vi khuẩn. Đặt ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau đọc kết quả.
Phơng pháp này hiện nay còn một số điểm cha thống nhất phải tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh thêm.
Trong thực tế ta có thể nuôi vi khuẩn ở môi trờng nớc thịt có gan phía trên tráng một lớp dầu parafin để tạo môi trờng yếm khí. Sau khi cho các Phytoncid cần thử và cấy vi khuẩn vào, ta cũng đặt tủ ấm 370C/12 giờ sau độc kết quả.
Nếu ống nghiệm vẫn trong suốt, giữ nguyên mẫu canh thang, tức là vi khuẩn không phát triển đợc, chứng tỏ Phytoncid đó có tác dụng chống vi khuẩn yếm khí.
2) Phơng pháp định lợng
Mục đích của Phơng pháp:
Định lợng cho ta biết đợc mức độ tác dụng mạnh của Phytoncid. Thờng sử dụng các Phơng pháp sau để tiến hành định lợng.
1) Phơng pháp hệ nống độ pha loãng
Nó đợc áp dụng rộng rãi khi nghiên cứu vi khuẩn học và tính chống chịu kháng sinh ở cả 2 loại môi trờng đặc biệt (thạch) và lỏng (canh thang).
a- Trong môi trờng đặc: Dung dịch chất cần thử (Phytoncid) đã pha sẵn trong n-
ớc cất vô trùng, nồng độ 1/10: 1/100 sau đó cứ 1ml chất thử ở các nồng độ khác nhau đem trộng đều với 4ml môi trờng thạch ở 45-480C trong ống nghiệm vô trùng, lắc thật đều để yên cho môi trờng đông lại, sau đó nuôi ống cây một vật nhỏ vi khuẩn cần thử lên mặt thạch, đặt tủ ấm 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết quả, ta tìm đợc nồng độ thấp nhất có tác dụng của thuốc với vi khuẩn. Đó là nồng độ tối thiểu tác dụng của chất kháng sinh.
b- Trong môi trờng loãng: Phơng pháp này đã đợc Fleming dùng để xác định tác
dụng dợc lý của Penixilin. Phơng pháp này cũng cơ bản giống Phơng pháp trên nhng đợc thay 4 ml thạch bằng 4ml canh thang và cấy vi khuẩn cần thử vào. Yêu cầu của Phơng pháp này: số lơng vi khuẩn cấy vào từng loại nồng độ giống nhau. Thờng là lấy 1 que cấy.
Yêu cầu chung của Phơng pháp hệ nồng độ pha loãng là:
+ Số lợng vi khuẩn trong từng nồng độ phải đợc xác định và ít nhất là phải giống nhau về số lợng vi khuẩn.
+ Vi khuẩn thí nghiệm phải nuôi trong môi trờng luôn luôn có các thành phần giống nhau với nhiệt độ xác định và tuổi giống nhau.
+ Trong môi trờng loãng, muốn có kết quả chính xác về nồng độ tối tiểu tác dụng, ta có thể chọn 2-3 ống nghiệm liền nhau ở nồng độ nghỉ ngờ , cấy lên 2-3 đĩa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thạch để tủ ấm 24 giờ (mỗi ống cấy 1 đĩa). Nếu vi khuẩn ở đĩa nào không mọc (nhng phải liền với ống có nồng độ thấp hơn vi khuẩn vẫn mọc). Ta gọi nồng độ ở đĩa đó là nồng độ tối thiểu tác dụng của Phytoncid với vi khuẩn cần thử.
2) Phơng pháp khuếch tán:
Phơng pháp náy đợc áp dụng phổ biến ở các cơ sở sản xuất do Reddish tìm ra năm 1920 sau đó đợc Abranam (1941) cải tiến để xác định hàng loạt tính kháng khuẩn của penixilin.
Nội dung và Phơng pháp tiến hành nói chung giống Phơng pháp đặt khâu của Healley, chỉ khác: mỗi một ống khâu trong hộp lồng ta nhỏ một loại nồng độ kháng sinh nhất định. Trong từng hộp lồng ta nên bố trí xen kẽ có khân nhỏ dung dịch chuẩn đã biết trớc nồng độ để sau này đánh giá, so sánh xem mức độ tác dụng của từng nồng độ so với thuốc chuẩn. Đặt hộp lồng vào tủ 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết quả.
3) Phơng pháp xác định độ đục
Phơng pháp nàu rất chính xác và nhanh, chỉ trong vòng 2-3 giờ chờ vi khuẩn mọc.
Phơng pháp này dựa trên cơ sở quan hệ số học giữa mức độ kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn với nồng độ của Phytoncid có trong dung dịch.
Ngời ta pha loãng dung dịch chuẩn của Phytoncid ở các nồng độ khác nhau nh phơng pháp hệ nồng độ pha loãng. Dung dịch này đem trọng vào môi trờng canh thang. Cấy vi khuẩn vào. Mỗi ống nghiệm một que cấy vi khuẩn để khống chế nồng độ vi khuẩn trong từng ống là giống nhau. Đặt tủ ấm 370C sau 2 – 3 giờ. Ta có thể đo độ đục của môi trờng để biết tốc độ phát triển của vi khuẩn, bằng máy đo quang kế Spekol hoặc các pek ở phòng thí nghiệm.
Nồng độ tác dụng của dung dịch Phytoncid cần thử đợc tính theo mức độ tác dụng của dung dịch Phytoncid chuẩn đã biết trớc nồng độ.
Phơng pháp này yêu cầu hàng ngày xác định đồ thị của nồng độ dung dịch chuẩn.
Cây tỏi Tên khác : Đại toán (Trung Quốc) Tên Khoa học: Allium sativnm.I Họ Hành tỏi: Liliaceae.