- Các dạng nước trong cây.
3. Dinh dưỡng Nitơ (nitrogen) của thực vật 1 Vai trò của Ni tơđối với thực vật.
3.4.2. Các nhóm vi sinh vật cố định đạm.
Dựa vào nhu cầu O2 có thể phân biệt vi sinh vật cốđịnh đạm sống tự do trong đất thuộc hai nhóm: nhóm hiếu khí và nhóm kị khí.
- Nhóm vi sinh vật hiếu khí sống tự do trong đất thường gặp như loài
Azotobacter chroococcum, A. Vinelandii và nhiều loài khác trong chi
Azotobacter. Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ
giữa Azotobacter và cây trồng. Chúng có tác dụng làm tăng cường nguồn
thức ăn N cho cây. Nhờđặc tính oxy hóa hiếu khí trong quá trình trao đổi chất nên hiệu quả cốđịnh N cao hơn nhiều so với nhóm kị khí. Trung bình khi tiêu thụ 1g glucoza, Azotobacter có khả năng đồng hóa được 10-15mg N2. Tác dụng của Azotobacter đối với cây trồng còn được chứng minh ở khả năng tạo các chất kích thích sinh trưởng như thymine, acid nicotinic, acid pantotenic, biotin....
Ngoài ra còn có chi Beijerinckia cũng là loại vi khuẩn hiếu khí cố định N2 nhưng có khả năng chịu chua cao hơn nhiều so với Azotobacter.
- Nhóm vi sinh vật kị khí sống tự do thuộc chi Clostridium, đặc biệt là loài C. pasteurianum có hoạt tính cốđịnh N2 cao hơn các loài khác của chi này. Từ quá trình lên men butyric:
C6H12O6 C3H7COOH + 2CO2 + 4H+
Hydro trong quá trình này được Clostridium sử dụng để kết hợp với ni tơ
2N2 + 3H2 2NH3
Hiện nay ngoài loài C. pasteurianum người ta còn nhận thấy có nhiều loài thuộc chi Clostridium khác cũng có khả năng cốđịnh ni tơ phân tử. Đó là các loài C. butyricum. C. butylicum, C. beijerinckia, C. aceticum, C. multifermentans, C. pectinovorum, C. acetobutylicum, C. felsineum.
Vi khuẩn thuộc loài C. pasteurianum thường có hoạt tính cốđịnh ni tơ cao hơn các loài Clostridium khác. Khi đồng hóa hết 1 g thức ăn carbon, chúng thường tích lũy được khoảng 5-10 mg ni tơ. Khả năng cố định ni tơ của các loài trong chi Clostridium còn phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện nuôi cấy. Việc bổ sung các phân khoáng chứa P, K và Mo vào đất thường làm tăng cường sự phát triển của Clostridium trong đất. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở những vùng đất chua, khi không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt với số lượng đáng kể. Số lượng của chúng trong vùng rễ bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ .
* Vi khuẩn lam (tảo lam) sống tự do và cộng sinh
Vi khuẩn lam thường sống ở các ruộng lúa vùng châu Á, tiêu biểu là các loài như Aulosira fertilissima (Ấn Độ), Tolypothrix (Nhật Bản),
Anabaena azotica (Trung Quốc)... Đa số các loài vi khuẩn lam có khả năng cốđịnh N2 sống tự do trong đất và trong nước, nhưng cũng có một số ít loại có đời sống cộng sinh với thực vật. Chẳng hạn các dạng cộng sinh với nấm trong một số loài địa y. Một số loài tảo lam cố định N2 có đời sống nội sinh trong các xoang của địa tiền hoặc còn gặp ở cả một số loài d- ương xỉ, một số loài tuế.
Đặc biệt đáng chú ý là loài Anabaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu (bèo hoa dâu là một loài dương xỉ thuộc giống Azolla) một loại cây dùng làm phân xanh và làm thức ăn gia súc có ý nghĩa rất lớn ở các n- ước châu Á. Anabaena azollae sống trong khoang khí của bèo hoa dâu gồm rất nhiều sợi tảo trông giống như những chuỗi hạt. Bottoley cho rằng trong khoang lá bèo hoa dâu ngoài vi khuẩn lam Anabaena còn có các loại
Pseudomonas radicicola và các loại Azotobacter. Vi khuẩn lam đã cung
cấp cho các vi khuẩn khác các sản phẩm của quang hợp, còn vi khuẩn thì lại cung cấp ni tơđã cốđịnh được cho vi khuẩn lam.
Ngoài dạng cộng sinh với bèo hoa dâu, một số loài vi khuẩn lam còn có thể cộng sinh trong các nốt sần của loài cỏ ba lá (Trifolium
alexandrinume). Đa số các loại vi khuẩn lam có khả năng cốđịnh N2 thích
hợp phát triển trong các môi trường trung tính hoặc kiềm.
Bổ sung vào đất các chất hữu cơ giàu carbon (rơm, rạ...), phân phosphor và phân kalium là những biện pháp rất tích cực đểđẩy mạnh sự phát triển của vi khuẩn lam và làm tăng cường hoạt động cốđịnh ni tơ của chúng. Trong số các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với sự phát triển và đối với hoạt động cốđịnh nitơ của vi khuẩn lam đáng chú ý hơn cả Mo, B, Co, Mn, ...
* Vi khuẩn nốt sần cộng sinh
Vai trò cố định N2 quan trọng nhất thuộc về nhóm vi sinh vật cộng sinh. Hiện nay, người ta đã phát hiện được hơn 600 loài cây có vi sinh vật sống cộng sinh có khả năng đồng hóa N2 thuộc nhiều họ khác nhau. Ở một số cây gỗ hoặc cây bụi nhiệt đới thuộc họ Rabiaceae, các nốt sần chứa vi khuẩn cốđịnh N2 không phải ở rễ mà ở trên lá.
Đối với nông nghiệp thì cây họđậu vẫn có giá trị nhất, chúng có thể cố định được khoảng 80-300 kg N/ha. Ví dụ như cây linh lăng có thể cố định được 300kg N/ha, đậu cô ve 80-120 kg/ha. Vi khuẩn sống cộng sinh trong cây bộ đậu (Leguminosales) được xếp vào một chi riêng là Rhizobium, nhưng hiện nay người ta chia vi khuẩn nốt sần thành 2 nhóm:
- Nhóm mọc nhanh (vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá, đậu Hòa Lan, mục túc...) thuộc chi Rhizobium. Đây là nhóm vi sinh vật có hoạt động cố định N2 mạnh nhất
- Nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tương, lạc...) thuộc chi
Bradyrhizobium.
Các vi sinh vật này thường tập trung ở vùng gần chóp rễ, nơi tập trung nhiều polysaccharide và vùng hình thành lông hút. Rễ cây tiết ra nhiều chất như đường, acid hữu cơ, acid amine, vitamine, flavonoid. . . hấp dẫn vi sinh vật. Các vi khuẩn xâm nhập vào cây qua lông hút và vào tế bào nhu mô rễ. Đôi khi nó có thể đi qua những tế bào bị thương của biểu bì, đặc biệt là ở chỗ phân nhánh của rễ bên. Vi khuẩn nốt sần tác động trở lại bằng cách sản sinh ra một chất nhầy ngoại bào có bản chất polysaccharide. Chất này thúc đẩy cây tổng hợp nên enzyme polygalacturonase tác động nên màng lông rễ, làm cho màng mềm dẻo hơn và vi khuẩn có thể xâm nhập dễ dàng hơn. Nếu vi khuẩn nốt sần của một loài nhất định nào đó không thể lây nhiễm được thì chúng không kích thích hình thành enzyme polygalactoronase ở rễđược. Khi nào nhu mô rễ, vi khuẩn hòa tan vỏ tế bào và dưới ảnh hưởng của gen vi khuẩn, các tế bào nhu mô vỏđa bội hóa và phân chia nhanh để hình thành nên các nốt sần.
Người ta chia các vi khuẩn nốt sần ra làm nhiều chủng, mỗi chủng ứng với một nhóm cây họđậu nhất định. Ngoài ra trong phạm vi cùng một chủng vi khuẩn nốt sần cũng có nòi có hiệu quả và không có hiệu quả. Những nòi không có hiệu quá cũng có thể lây nhiễm vào rễ cây họ đậu tương ứng nhưng không đồng hóa được N2 hay đồng hóa kém và sống trong các nốt sần như cơ thể kí sinh.
Mối quan hệ tương hỗ giữa các cây họđậu và các vi khuẩn nốt sần là quan hệ cộng sinh. Cây họđậu cung cấp glucid, nguồn năng lượng ATP và các chất khử như NADH2 để vi khuẩn tiến hành hoạt động khử N2 thành NH3 và vi khuẩn cung cấp cho cây các hợp chất ni tơ mà chúng cố định được từ không khí. Tuy nhiên khi mới nhiễm vào rễ, vi khuẩn sống như dạng kí sinh, chưa đồng hóa được N2, do đó cây vẫn cần phân đạm. Nếu thiếu đạm và gặp điều kiện bất lợi, sinh trưởng của cây sẽ yếu thậm chí cây sẽ chết.
Vào cuối thời kỳ sinh trưởng của cây thì số lượng vi khuẩn nốt sần giảm xuống và biến thành dạng bacteroid. Khi nốt sần bị thối thì vi khuẩn nốt sần vẫn sống và đi ra đất, sinh sản chậm và sống ở trạng thái hoại sinh. 3.4.3. Cơ chế cốđịnh N2 của vi sinh vật
Cơ chế hóa sinh của quá trình cốđịnh N2 cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng NH3 là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con đường cốđịnh N2 của vi sinh vật sống tự do trong đất như hình 7.
Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16-20 Kcalo/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống enzyme hydrogenase họat hóa H2 và enzyme nitrogenase hoạt hóa N2.
Năm 1961-1962, người ta đã tách từClostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạt hóa H2 Và N2. Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter
cũng có các tiểu phần đó. Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe.
N N Khử +2H+ oxy hóa + 1/2 O2 HN =NH N2O + 2H+ + 2H2O + H2O H2N-NH2 2NH2OH (HNO)2 +2H+ + 2H+ 2NH3 Oxim + 4H+ + 8H+ Acid amine
Hình 7: Sơđồ giả thuyết về các con đường của quá trình cốđịnh N2
Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2). Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tửđược chuyền theo hệ thống
2e- 2e- 2e-
H2 Flavin Mo Hệ nhận điện tử (N2) Cụ thể FAD + H2 FADH2
FADH2 + 2Mo6+ FAD+ + 2Mo5+ + 2H+ Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd).
CH3-CO-COOH + H3PO4 + Fd (dạng oxy hóa)
CH3-CO-O-PO3H2 + FdH2 (dạng khử) + CO2
Acetylphosphate
Acetylkinase
Acetylphosphate + ADP ATP + CH3COOH
Acetylphotphate ATP + AH2 Acetylkinase
2H+
Acid pyruvic Fd N2 N2
H2 NH3
Hydrogenase
Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.
Sự cốđịnh N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xãy ra theo sơđồ phức tạp hơn. Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các
Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cốđịnh được N2.
Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cốđịnh này đòi hỏi:
- Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí.
- Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP,...)
- Có năng lượng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng. Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họđậu thường có hiệu quả rất cao.
Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. Sự cốđịnh N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2.
NH3 tạo thành trong quá trình cốđịnh N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác.