Phương pháp nghiên cứu

3.5.1. Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang, nghiên cứu can thiệp và các nghiên cứu thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh và Trương Quang (2011).

3.5.1.1. Chọn mẫu

- Chọn mẫu và thu thập mẫu nghiên cứu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, bậc cuối cùng là các thôn/xóm. Số lợn mổ khám và xét nghiệm phân ở các thôn/xóm được lấy ngẫu nhiên. Vì vậy, có lợn khỏe (không bị nhiễm ký sinh trùng), có lợn nhiễm ký sinh trùng, có lợn tiêu chảy, có lợn phân bình thường. Tuy nhiên đã loại bỏ những lợn mắc bệnh truyền nhiễm và các bệnh khác như bệnh nội khoa, ngoại khoa và bệnh sản khoa.

3.5.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu

- Cỡ mẫu cần lấy để điều tra được lấy theo công thức dịch tễ học củaNguyễn Như Thanh và cs. (2001):

  2 1 2  96 , 1 d P P N  

Trong đó: + N là dung lượng mẫu cần nghiên cứu.

+ P là tỷ lệ lưu hành giun tròn đường tiêu hóa của lợn ước đoán. + d là sai số ước lượng.

Sử dụng tỷ lệ ước đoán trong nghiên cứu điều tra của tác giả Nguyễn Thị Kim Lan (2009) về tỷ lệ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa ở lợn xấp xỉ 60%, thì tổng số mẫu cần nghiên cứu tại ba tỉnh là 11016 lợn, trong đó một xã mổ khám 40 lợn và xét nghiệm 368 mẫu phân. Như vậy, tại 3 tỉnh nghiên cứu có 9936 lợn được xét nghiệm phân và 1080 lợn được mổ khám.

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu hành phần loài, tỷ lệ và cường độ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn

3.5.2.1. Phương pháp thu thập và xét nghiệm mẫu giun tròn đường tiêu hóa của lợn

- Tiến hành thu thập và xét nghiệm 9936 mẫu phân lợn ở các lứa tuổi, nuôi tại các hộ gia đình thuộc 3 tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn và Thái Nguyên.

- Lấy mẫu và bảo quản mẫu theo phương pháp thường quy trong nghiên cứu ký sinh trùng.

- Xét nghiệm mẫu phân lợn bằng phương pháp Fullerborn (Phạm Văn Khuê và Phan lục, 1996).

3.5.2.2. Phương pháp mổ khám

- Mổ khám 1080 lợn từ 6 tháng tuổi trở lên tại các hộ kinh doanh thịt lợn và các hộ gia đình nuôi lợn ở 3 tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn và Thái Nguyên. Theo phương pháp mổ khám toàn diện đường tiêu hóa lợn của Skrjabin (1928) (Phạm Văn Khuê và Phan lục, 1996).

- Mẫu giun tròn đường tiêu hóa thu được của mỗi lợn được bảo quản ở từng lọ riêng. Trước hết để giun chết tự nhiên trong nước lã, sau đó đưa vào bảo quản bằng dung dịch Barbagalo. Mỗi lọ đều có nhãn ghi số thứ tự, loại lợn, tuổi lợn, địa điểm, thời gian mổ khám, nơi ký sinh của giun, số lượng giun ký sinh/lợn (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996).

3.5.2.3. Phương pháp xác định thành phần loài giun tròn đường tiêu hóa của lợn

Quá trình định loại được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Ký sinh trùng, Bộ môn Bệnh động vật, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

- Chuẩn bị mẫu giun để định loại: Các mẫu giun sau khi thu thập về được bảo quản bằng dung dịch Barbagalođể tránh hư hỏng. Trước khi định loại ngâm giun trong dung dịch Lactophenol để làm trong giun.

kính hiển vi về hình thái các bộ phận: đầu, miệng, phễu miệng, gai cổ, thực quản, túi đuôi, gai giao cấu của giun đực, âm hộ hay cơ quan thải trứng của giun cái. Từ đó phân loại theo khóa định loại của Phan Thế Việt và cs. (1977), Nguyễn Thị Lê và cs. (1996). Chuyển các mẫu giun tới Phòng Ký sinh trùng học, Viện sinh thái - Tài nguyên sinh vật để giám định, đồng thời chọn một số giun dạ dày phát hiện được trong vùng nghiên cứu gửi tới Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương chụp tiêu bản siêu cấu trúc bằng kính hiển vi điện tử quét.

- Định loại trứng giun tròn đường tiêu hóa lợn qua đặc điểm hình thái, cấu tạo và màu sắc của trứng, phân loại theo khoá định loại của Monnig (Trịnh Văn Thịnh, 1963).

3.5.2.4. Xác định những yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn trong quá trình thu thập mẫu

+ Dựa vào bản đồ địa lý của 3 tỉnh nghiên cứu phân thành 3 vùng địa hình khác nhau: vùng đồng bằng, vùng bán sơn địa và vùng núi cao. Trong đó Cao Bằng chọn huyện Hòa An là vùng đồng bằng, huyện Trà Lĩnh là vùng bán sơn địa và huyện Quảng Uyên là vùng núi cao. Bắc Kạn chọn huyện Chợ Mới là vùng đồng bằng, huyện Ba Bể là vùng bán sơn địa, huyện Ngân Sơn là vùng núi cao. Thái Nguyên chọn huyện Đồng Hỷ là vùng đồng bằng, huyện Phú Lương là vùng bán sơn địa, huyện Võ Nhai là vùng núi cao.

+ Mùa vụ trong năm được làm 2 vụ: Vụ Xuân - Hè là từ tháng 1 đến tháng 6, vụ Thu - Đông là từ tháng 7 đến tháng 12.

+ Tình trạng vệ sinh được chia làm 3 mức: Vệ sinh thú y tốt là chuồng trại, máng ăn, máng uống được cọ rửa thường xuyên, phân được thu gom đem ủ; vệ sinh thú y trung bình là chuồng trại, máng ăn, máng uống không được cọ rửa thường xuyên, để phân lưu cữu trong chuồng vài ngày đến 1 tuần; vệ sinh thú y kém là chuồng trại, máng ăn, máng uống ít khi được dọn và cọ rửa, để phân lưu cữu trong chuồng vài tuần đến vài tháng.

+ Phương thức nuôi được chia làm 3 phương thức: Nuôi thả rông là hình thức nuôi lợn được thả tự do hoàn toàn; nuôi bán chăn thả là hình thức nuôi có giai đoạn lợn được nhốt trong chuồng, có giai đoạn lợn được chăn thả tự do; nuôi nhốt hoàn toàn là hình thức nuôi lợn được nhốt hoàn toàn trong chuồng.

+ Tuổi lợn nghiên cứu tại 3 tỉnh được chia thành 5 giai đoạn: nhỏ hơn hoặc bằng 2 tháng tuổi, lớn hơn 2-4 tháng tuổi, lớn hơn 4-6 tháng tuổi, lớn hơn 6- 8 tháng tuổi và lớn hơn 8 tháng tuổi.

3.5.2.5. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn tại ba tỉnh nghiên cứu

- Mổ khám lợn theo phương pháp mổ khám toàn diện đường tiêu hóa lợn của Skrjabin (1928), để kiểm tra số lượng giun, số loài giun tròn đường tiêu hóa, qua đó xác định được tỷ lệ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn qua mổ khám (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996).

- Đánh giá cường độ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn qua mổ khám được xác định bằng trị số min (nhỏ nhất) và chỉ số max (lớn nhất) (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996).

- Các mẫu phân lợn được xét nghiệm bằng phương pháp Mc. Master (Phạm Văn Khuê và cs., 1996) để kiểm tra số lượng trứng giun và số loài trứng giun tròn đường tiêu hóa, từ đó xác định được tỷ lệ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn qua xét nghiệm phân.

Thu thập mẫu phân: lấy từ 5-10g, cho vào túi nilon, buộc kín, ghi chép các thông tin cần thiết như tuổi của lợn (hỏi chủ nuôi), ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, phương thức nuôi, tình trạng vệ sinh, loại lợn. Mẫu phân được xét nghiệm trong ngày.

- Đánh giá cường độ nhiễm giun tròn đường tiêu hóa của lợn qua xét nghiệm phân bằng phương pháp Mc. Master (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996).

Căn cứ vào kết quả xét nghiệm phân chúng tôi quy định cường độ nhiễm trứng giun thành bốn mức: ≤500 trứng/gam phân là nhiễm cường độ nhẹ; >500- 800 trứng/gam phân là nhiễm cường độ trung bình; >800-1000 trứng/gam phân là nhiễm cường độ nặng và >1000 trứng/gam phân là nhiễm cường độ rất nặng (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996).

3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của giun dạ dày lợn

3.5.3.1. Phương pháp theo dõi sự phát triển của trứng và ấu trùng giun dạ dày trong môi trường nước cất ở điều kiện phòng thí nghiệm

trưởng thành, quá trình được thực hiện như sau: cho giun vào đĩa petri, dùng kéo cắt thành những đoạn nhỏ. Bơm vào 1ml nước cất, dùng đầu đũa thủy tinh dầm cho trứng tan ra khỏi buồng trứng. Sau đó dùng hiển vi để kiểm tra mật độ của trứng. Nếu số lượng trứng còn ít, chưa đủ số trứng cần thiết để cho thí nghiệm thì tiếp tục cho thêm giun vào dầm tiếp cho đến khi kiểm tra số lượng trứng có thể đủ cho thí nghiệm thì dừng lại. Cho thêm từ 15-20ml nước cất vào đĩa petri, dùng đũa thủy tinh khuấy đều và đổ vào một cốc đong thông qua một giá lọc. Giữ lại phần dung dịch của cốc đong, bỏ đi phần trên của giá lọc. Đem phần dung dịch trong cốc đong vào ly tâm, tốc độ 1000 vòng/phút, sau 3 phút lấy ra gạn phần nước trong ở phía trên đi, giữ lại phần ở dưới đáy ống nghiệm, cho thêm 1ml nước cất vào khuấy đều và đổ ra đĩa petri. Như vậy, quá trình thu trứng giun dạ dày lợn đã hoàn tất.

- Đếm trứng bằng phương pháp tự tạo quá trình được thực hiện như sau: dùng công tơ hút nước trứng ở đĩa petri đã ly tâm, nhỏ một giọt lên bề mặt của lam kính. Đem soi dưới kính hiển vi đếm số lượng trứng có trong một giọt, ghi lại số lượng trứng vừa đếm được. Dùng công tơ khác hút nước cất rửa sạch giọt nước vừa soi xuống một đĩa petri khác. Tiếp tục thao tác như trên đến khi nào đủ số lượng trứng cần dùng thì dừng lại.

- Nuôi trứng theo kỹ thuật nuôi của Đỗ Dương Thái và Trịnh Văn Thịnh (1976). Dùng 4 đĩa petri đã có sẵn 50ml nước cất, pH = 7, dùng công tơ hút trứng giun dạ dày thu được vào nuôi, mỗi đĩa 100 trứng và để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm từ 22-280

C. Hàng ngày kiểm tra và lắc đảo đĩa petri để tăng hàm lượng oxy hòa tan.

Quan sát sự phát triển của trứng giun thông qua quá trình phát triển của tế bào phôi. Sự hình thành ấu trùng, quá trình nở của ấu trùng và kích thước của ấu trùng sau khi nở ở trong môi trường nước cất. Tiếp tục theo dõi sự tồn tại của ấu trùng trong thời gian nuôi bằng kính hiển vi quang học. Mô tả hình thái ấu trùng dựa theo nguồn tài liệu của Bowman (1999).

- Phương pháp đo kích thước của trứng và ấu trùng giun dạ dày + Đo kích thước của trứng bằng trắc vi thị kính.

+ Đo kích thước của ấu trùng bằng kỹ thuật trắc vi thị kính sau khi giết chết ấu trùng trên ngọn lửa đèn cồn.

3.5.3.2. Phương pháp theo dõi sự phát triển của trứng giun dạ dày trong môi trường pH khác nhau

Dùng 8 đĩa petri mỗi đĩa 120 trứng, trong đó 2 đĩa chứa sẵn axit axetic có pH=5; 2 đĩa chứa nước cất có pH=7 và 2 đĩa chứa NaOH có pH=9 và 2 đĩa chứa NaOH có pH=11. Dùng công tơ hút trứng giun dạ dày vào nuôi, mỗi đĩa 60 trứng để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm từ 22-280C. Hàng ngày kiểm tra, lắc đảo đĩa petri để tăng hàm lượng oxy hòa tan.

Các chỉ tiêu theo dõi: hình thái, kích thước, màu sắc của trứng, sự biến đổi tế bào phôi trong trứng. Ghi chép, chụp ảnh mô tả những biến đổi của trứng và ấu trùng trong các môi trường nuôi.

3.5.3.3. Phương pháp theo dõi sự phát triển của trứng giun dạ dày trong môi trường hóa chất thông dụng

Dùng 6 đĩa petri, mỗi đĩa 120 trứng chứa sẵn dung dịch hóa chất, trong đó 2 đĩa chứa NaCl, nồng độ 5% và 10%; 2 đĩa chứa NaOH, nồng độ 5% và 10%, và 2 đĩa chứa Ca (OH)2, nồng độ 5% và 10%. Đưa trứng giun dạ dày vào nuôi, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm từ 22-280C. Hàng ngày kiểm tra, lắc đảo đĩa petri để tăng hàm lượng oxy hòa tan.

Các chỉ tiêu theo dõi: sự biến đổi về hình thái, kích thước, màu sắc của trứng, sự biến đổi tế bào phôi và ấu trùng trong trứng. Ghi chép, chụp ảnh mô tả sự biến đổi của trứng và ấu trùng trong các môi trường nuôi.

3.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh học do giun dạ dày gây ra ở lợn tại ba tỉnh nghiên cứu lợn tại ba tỉnh nghiên cứu

3.5.4.1. Phương pháp xác địnhbệnh tích đại thể

Tiến hành mổ khám 20 lợn nhiễm giun dạ dày ở cường độ từ 500-800 trứng/gam phân, bằng phương pháp mổ khám toàn diện đường tiêu hóa của Skrjabin (1928) (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996). Quan sát những biến đổi về bệnh tích đại thể ở các cơ quan như: gan, phổi, thực quản, dạ dày, nơi ấu trùng di hành và vị trí ký sinh của giun trưởng thành. Ghi chép các thông tin về bệnh tích, chụp ảnh và mô tả.

3.5.4.2. Phương pháp xác định bệnh tích vi thể

Chọn 9 lợn mổ khám để nghiên cứu tổn thương vi thể, là những lợn chỉ bị nhiễm riêng loài giun dạ dày ở cường độ từ 500-800 trứng/gam phân, không bị bệnh Truyền nhiễm và các bệnh khác. Mổ khám những lợn này, thu thập những vùng bệnh tích điển hình (vùng niêm mạc dạ dày tổn thương có giun ký sinh). Cố

định bệnh phẩm bằng dung dịch formon 10%. Tiêu bản vi thể được làm theo quy trình tẩm đúc Parafin, nhuộm tiêu bản bằng Hematoxilin – Eosin (HE) tại Bộ môn Bênh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mỗi mẫu bệnh phẩm của một lợn được nghiên cứu 4 block. Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại tối đa 400 lần, chụp ảnh và mô tả.

3.5.4.3. Phương pháp xét nghiệm máu xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn bị nhiễm giun dạ dày

Chúng tôi tiến hành xét nghiệm máu của 18 lợn từ 6 đến 8 tháng tuổi. Thí nghiệm được chia thành 2 lô, lợn ở 2 lô phải đồng đều về giống, tuổi, khối lượng. - Lô thí nghiệm: chọn 9 lợn chỉ bị nhiễm giun dạ dày qua xét nghiệm phân có cường độ từ 500-800 trứng/gram phân, không mắc bệnh Truyền nhiễm và các bệnh khác.

- Lô đối chứng: chọn 9 lợn được xác định không bị nhiễm giun, sán, không bị mắc bệnh Truyền nhiễm và các bệnh khác.

* Phương pháp lấy máu làm xét nghiệm

Mẫu máu dùng cho xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học phải được lấy vào buổi sáng trước khi cho lợn ăn. Cố định lợn bằng phương pháp tròng mõm, lấy 5 ml máu từ tĩnh mạch cổ bằng xy lanh vô trùng rồi cho vào ống nghiệm có chứa chất chống đông citrat natri 3,8%, đậy nắp, ghi nhãn, bảo quản lạnh, vận chuyển đến phòng thí nghiệm và mẫu máu được xét nghiệm ngay trong ngày.

* Xác định một số chỉ tiêu huyết học: một số chỉ tiêu huyết học máu lợn được xác định bằng máy đo huyết học tự động CD - 3700.

Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/mm3). + Hàm lượng huyết sắc tố HGB, g%). + Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/mm3). + Công thức bạch cầu (%).

3.5.5. Phương pháp nghiên cứu các biện pháp phòng trị bệnh giun dạ dày lợn dày lợn

3.5.5.1. Phương pháp thử nghiệm hiệu lực tẩy trừ giun dạ dày lợn bằng thuốc ivermectin, levamisole và mebendazole

- Thử nghiệm thuốc tẩy trừ giun dạ dày lợn bằng phương pháp phân lô so sánh được thực hiện qua thực nghiệm và trên thực địa.

* Thử nghiệm hiệu lực tẩy trừ giun dạ dày lợn bằng thuốc ivermectin, levamisole và mebendazole trên diện hẹp

- Chúng tôi thử nghiệm hiệu tẩy trừ của 3 loại thuốc trên cho 20 lợn đã được kiểm tra bị nhiễm giun dạ dày. Trong đó 3 loại thuốc tẩy mỗi loại tẩy cho một lô, còn lại một lô đối chứng không tẩy. Sau khi dùng thuốc được 24 giờ, tiến hành kiểm tra thu thập xác giun ra theo phân trong vòng 5 ngày. Sau khi tẩy được 15 ngày tiến hành mổ khám lợn để xác định số lượng giun còn lại chưa bị tẩy.

- Xác định khối lượng lợn để tính liều lượng thuốc bằng cách: cân đối với lợn