b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được
tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải đông
Tế bào trứng được bảo quản lạnh thành công tức là tế bào trứng có khả năng phát triển sau đông lạnh – giải đông như tế bào trứng không đông lạnh. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ tế bào trứng phân chia của nhóm 24 giờ là cao hơn so với các nhóm còn lại (64,67%; P<0,05). Mặc dù nhóm 18 giờ có tỷ lệ thành thục không khác nhau so với đối chứng (P>0,05) nhưng tỷ lệ tế bào trứng phân chia của nhóm 18 giờ vẫn thấp hơn so với nhóm 24 giờ (53,73% so với 64,67%; P<0,05). Điều đó cho thấy hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn chưa thành thục thấp hơn so với tế bào trứng ở giai đoạn thành thục. Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng chưa thành thục bị nhiều tổn thương lạnh hơn trong quá trình đông lạnh – giải đông.
Bảng 15. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau
Thời gian nuôi in vitro
Số tế bào trứng được thụ
tinh
Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào trứng % (M ± SE) Số phôi dâu, phôi nang % (M ± SE) 0h 336 127 37,8d ± 0,76 13 10,24c ± 1,57 6h 327 126 38,53d ± 0,47 12 9,52c ± 0,98 12h 329 132 40,12d ± 0,65 15 11,36c ± 1,68 18h 335 180 53,73c ± 0,62 24 11,67c ± 0,97 24h 334 216 64,67b ± 0,92 42 19,44b ± 1,14 Đối chứng (Tế bào trứng không đông lạnh) 263 205 77,95a ± 2,24 78 29,66a ± 1,66
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
Thêm vào đó bộ khung xương tế bào của tế bào trứng thành thục có độ linh hoạt hơn so với tế bào trứng chưa thành thục, nên chúng ít chịu những tổn thương lạnh (Allworth và Albertini, 1993). Ngoài ra sự khác nhau về mức độ chịu đựng tổn thương lạnh của tế bào trứng ở hai giai đoạn chưa thành thục và thành thục có thể là do khả năng thấm màng thấp và độ nhạy cảm của bộ khung xương tế bào (Hong và cs., 1999) và sự khác nhau về tính thấm màng trong suốt quá trình đông lạnh – giải đông (Parnpai và cs., 2014; Agca và cs., 2000).
Hình 15. Phôi dâu trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)
Mối liên kết giữa tế bào trứng và các tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng có vai trò quan trọng trong việc hoàn thiện quá trình thành thục của tế bào trứng. Sự vắng mặt của các tế bào nang có thể gây ra những thiếu sót trong quá trình tổng hợp protein và ảnh hưởng đến các yếu tố điều chỉnh sự thành thục tế bào trứng ở mức độ phân tử (Liang, 2010). Chính vì vậy sự thành công của việc bảo quản lạnh tế bào trứng chưa thành thục còn phụ thuộc vào khả năng bảo toàn sự toàn vẹn cấu trúc và chức năng của tế bào nang.
Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng thể hiện ở khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá sự phát triển tiếp theo của các tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông đến giai đoạn phôi dâu, nang. Kết quả thể hiện ở bảng 15 cho thấy sự giảm có ý nghĩa của số lượng phôi dâu, phôi nang trong các nhóm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ so với đối chứng. Tế bào
trứng phát triển kém sau đông lạnh-giải đông là do chúng phải chịu những tổn thương trong quá trình bảo quản lạnh (Men và cs., 2002).
Quá trình thủy tinh hóa khử sợi polyme của sợi thoi vô sắc và giải phóng các tế bào hạt vỏ dẫn đến hiện tượng dị bội và tổn thương màng sáng (Kola và cs., 1988; Vincent và Johson, 1992). Thêm vào đó, khi tế bào trứng chưa thành thục được bảo quản lạnh dưới 40C sẽ gây cản trở cho sự hình thành sợi thoi vô sắc và sự thụ tinh trong khi đó đối với tế bào trứng thành thục thì chất bảo vệ lạnh và nhiệt độ thấp lại làm tổn thương thoi vô sắc, vi sợi actin, sự tổng hợp các vi ống và sự phân tán nhiễm sắc thể. Sự bất thường của thoi vô sắc cản trở sự thụ tinh và phát triển bình thường của phôi, bởi vì thoi vô sắc là một phần quan trọng cho sự hoàn thiện quá trình giảm phân, sự hình thành thể cực thứ nhất, sự di chuyển của tiền nhân. Khi sợi thoi vô sắc bị phá hủy sẽ dẫn đến sự phân tán nhiễm sắc thể, ngăn cản tế bào trứng thực hiện sự thụ tinh một cách bình thường và sự phát triển của phôi.
Kết quả thể hiện ở bảng 15 cho thấy tỷ lệ phát triển đến phôi dâu, phôi nang của nhóm 24 giờ (19,44%, P<0,05) là cao hơn so với các nhóm còn lại. Kết quả này cũng tương tự như báo cáo của Men và cs. (2002); El-shahat và Hammam (2005), El-nabby. (2013), Luna và cs. (2001), Mahmoud và cs. (2010a), Sharma và Loganathasamy (2007). Các tác giả trên cũng nhận thấy tỷ lệ phôi nang được tạo ra từ tế bào trứng ở giai đoạn thành thục Metaphase II sau đông lạnh – giải đông là cao hơn so với ở giai đoạn GV.
Tỷ lệ tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang của nhóm 24 giờ tuy cao hơn so với các nhóm còn lại nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng (29,66%; P<0,05). Kết quả này tương tự như báo cáo của Men và cs. (2002); El-shahat và Hammam (2005).
Hình 16. Phôi nang trâu giãn nở tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)
Mặc dù tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân MII có sự ổn định màng tốt hơn tế bào trứng chưa thành thục, tuy nhiên chúng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh lý như: tổn thương cấu trúc trục chính phân bào giảm nhiễm (Mandelbaum và cs., 2004), tăng sự sai lệch nhiễm sắc thể (Sathananthan và cs., 1988), tăng hiện tượng bội thể và giảm khả năng thụ tinh (Wood và cs., 1992). Thêm vào đó một số báo cáo đã chứng minh rằng việc tế bào trứng trải qua quá trình đông lạnh (Aman và Parks, 1994), tiếp xúc với các chất bảo vệ lạnh (Vincent và cs., 1989; Aigner và cs., 1992), hoặc trải qua quá trình bảo quản lạnh (Aigner và cs., 1992) có thể dẫn đến sự phân tán nhiễm sắc thể và phát triển thể dị bội do sự khử polymer và làm hỏng cấu trúc các vi ống của trục chính. Do đó sự phát triển kém của các tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông là do những tổn thương trong chính bản thân tế bào trứng chứ không phải là do thụ tinh thất bại (Men và cs., 2002).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng tế bào trứng ở giai đoạn GV hoặc giai đoạn phá vỡ túi mầm không phù hợp để bảo quản lạnh. Điều này là trái ngược với kết quả nghiên cứu của Barnes và cs. (1997). Các tác giả này cho rằng các tế bào trứng khi được bảo quản lạnh ở giai đoạn phá vỡ túi mầm có tỷ lệ phân chia và phát triển đến phôi nang là cao hơn so với giai đoạn túi mầm hoặc thành thục (MII). Thậm chí các tác giả này còn nhấn mạnh rằng việc lựa chọn giai đoạn trung gian có thể vượt qua được một số vấn đề khi bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn GV hoặc MII.
Cũng đồng quan điểm như vậy, Somfai và cs. (2012); Egerszegi và cs. (2013) cho rằng tế bào trứng lợn khi được thủy tinh hóa ở giai đoạn túi mầm có khả năng hoàn thiện quá trình thụ tinh và phát triển đến dâu, phôi nang cao hơn so với tế bào trứng lợn được thủy tinh hóa ở giai đoạn MII cùng một phương pháp thủy tinh hóa. Theo Somfai và cs. (2012), mặc dù tế bào trứng thành thục có tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông cao hơn tế bào trứng chưa thành thục, nhưng trong quá trình thủy tinh hóa các tế bào trứng ở giai đoạn MII gây ra sự kết hợp các dạng thay đổi khác nhau trong tế bào chất làm tổn thương đáng kể đến khả năng thụ tinh bình thường và phát triển phôi tiếp theo của tế bào trứng. Thậm chí Mehmood và cs. (2011b) còn cho rằng tế bào trứng trâu ở giai đoạn túi mầm (GV) được thủy tinh hóa trong DMSO hoặc PROH có tỷ lệ phân chia sau đông lạnh – giải đông là không khác nhau so với tế bào trứng không đông lạnh; còn tế bào trứng trâu ở giai đoạn thành thục MII có tỷ lệ phân chia thấp hơn so với đối chứng. Sự khác nhau về các kết quả nghiên cứu có thể là do yếu tố đặc trưng loài, dạng chất bảo vệ lạnh sử dụng, điều kiện của từng phòng thí nghiệm.
Kết quả ở mục 3.6.1, 3.6.2, 3.6.3 cho thấy, thời gian nuôi in vitro có ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Tế bào trứng trâu có thời gian nuôi in vitro 24 giờ cho tỷ lệ sống, thành thục in vitro trở lại, tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang sau đông lạnh – giải đông cao hơn so với tế bào trứng trâu được đông lạnh ở thời gian nuôi < 24 giờ.
CHƯƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
Các kết quả của nghiên cứu này đã khẳng định:
1. Phương pháp đông lạnh tiếp xúc 2 bước với Ethylene glycol (EG) (bước 1: 2 phút trong EG 3M; bước 2: 1 phút trong EG 6M) kết hợp với giải đông trong môi trường có chứa sucrose mang lại hiệu quả cao cho quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy trong điều kiện tại Việt Nam.
2. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa cực nhanh với cọng rạ hở (OPS) cho tỷ lệ tế bào trứng trâu sống sau đông lạnh –giải đông cao hơn so với các phương pháp đã thử nghiệm.
3. Đông lạnh tế bào trứng trâu ở giai đoạn nuôi thành thục in vitro 24 giờ cải thiện tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh –giải đông (98,31%); cải thiện tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang sau thụ tinh và nuôi phôi in vitro (19,44%).
4. Đã tạo được phôi dâu, phôi nang trâu in vitro từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông. Đây là kết quả thành công đầu tiên được công bố tại Việt Nam tính đến thời điểm này.
5. Đã xây dựng được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy tại Việt Nam. Đây cũng là phương pháp bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầu tiên được công bố tại Việt Nam tính đến thời điểm này.
4.2. ĐỀ NGHỊ
Kết quả của nghiên cứu này là công bố đầu tiên về bảo quản lạnh tế bào trứng trâu tại Việt Nam. Tuy nhiên để nâng cao tỷ lệ sống của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông, tỷ lệ tạo phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh –giải đông, nhằm mục đích bảo tồn cũng như tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu và sản xuất phôi trâu cần phải thực hiện thêm một số nghiên cứu khác như: nghiên cứu cải thiện môi trường nuôi phôi in vitro, cấy truyền phôi trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông, nghiên cứu tạo phôi trâu nhân bản từ tế bào trứng đông lạnh.
Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể được dùng làm tài liệu tham khảo trong nghiên cứu giảng dạy tại các trường Đại học hoặc được áp dụng cho các phòng thí nghiệm về công nghệ sinh sản.
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị Hương, Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông. Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Số 50: 92-100
2. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị Hương, Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến kết quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Số 51: 39 -47
TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Thị Thương Huyền, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Vũ Hoàng Linh, Lê Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc. 2012. Những tác động của Taxol lên việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa. Tạp chí sinh học, 34 (3SE): 299-305.
Nguyễn Thị Thương Huyền, Lâm Sơn Bích Trâm, Nguyễn Quốc Đạt, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc. 2014. Bảo quản lạnh tế bào trứng bò giai đoạn túi mầm bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và vi giọt. Tạp chí Sinh học, 36 (1se): 195-202.
Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên. 2013. Đông lạnh trứng lợn non bằng cryotop. Tạp chí sinh học, 35(4): 516-521.
* Tài liệu tiếng Anh
Abbas, E.H. 1998. Investigations on in vitro fertilization in buffaloes. Ph. D. Thesis, Zagazig University.
Abdoon, A.S.S., and O.M. Kandil. 2001. Factors affecting number of surface ovarian follicles and oocytes yield and quality in Egyptian buffaloes. Reproduction, Nutrition and Development 41: 71-77.
Abdoon, A.S.S., O. M. Kandil, T. Otoi, T. Suzuki. 2001. Influence of oocyte quality, culture media and gonadotropins on cleavage rate and development of in vitro fertilized buffalo embryos. Animal Reproduction Science 65: 215-223.
Agca,Y., J. J.J. Liu, E.S. Rutledge, Crister and J.K. Crister. 2000. Effect of osmotic stress on the developmental competence of germinal vesicle and metaphase II stage bovine cumulus oocytes complexes and its relevance to cryopreservation. Mol. Reprod Dev., 55: 212-219.
Aigner, S., J. Van der Elst, E. Siebzehnrubl, L. Wildt, N. Lang and A. Van Steirteghem. 1992. The influence of slow and ultra-rapid freezing on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocyte. Hum Reprod 7: 857-864.
Albarracin, J.L., R. Morato, D. Izquierdo and T. Mogas. 2005a.Vitrification of calf oocytes: effects of maturation stage and prematuration treatment on the nuclear and cytoskeletal components of oocytes and their subsequent development. Molecular Reproduction and Development, 72(2), 239–249 Albarracin, J.L., R. Morato, C. Rojas and T. Mogas. 2005b. Effects of
vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal and adult bovine oocytes. Theriogenology, 63(3), 890–901. Ali, A., M.A. Sirard. 2002. Effect of the absence or presence of various protein
supplements on further development of bovine oocytes during in vitro
Allworth, A.E. and D.F. Albertini. 1993. Meiotic maturation in cultured bovine oocytes is accompanied by remodeling of cumulus cell cytoskeleton. Develop. Boil., 158: 101-112.
Aman, R.R. and J.E. Parks. 1994. Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured oocytes. Biol. Reprod. 50: 103-110.
Antinori, M., E. Licata, G. Dani. 2007. Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries. Reproductive BioMedicine Online 14: 71-79.
Atabay, E.C., Y. Takahashi, S. Katagiri, M. Nagano, A. Koga and Y. Kanai. 2004.Vitrification of bovine oocytes and its application to intergeneric somatic cell nucleus transfer. Theriogenology, 61(1), 15–23.
Arav, A., Y. Zeron, S.B. Leslie, E. Behboodi, G.B. Anderson and J.H. Crowe. 1996. Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine oocytes. Cryobiology 33. 589–599.
Arav, A., Y. Zeron and A. Ocheretny. 2000. A new device and method for vitrification increases the cooling rates and allows successful cryopreservation of bovine oocytes. Theriogenology, 53, 248 (Abstract) Arav, A., S. Yavin, Y. Zeron, D. Natan, I. Dekel and H. Gacitua. 2002. New
trends in gamete’s cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology 187 77–81.
Barakat, A., H, H.M. El –Ashmaoui, A. Barkawi, S. A. Kandeal and El- Nahass. 2012. Ultra-structural study of Egyptian buffalo oocytes before and after in vitro maturation. African Journal of Biotechnology Vol. 11 (30), pp. 7592- 7602
Barnes, F.L., P. Damiani, C.R. Looney and R.T. Duby. 1997. The meiotic stage affects subsequent development of cooled bovine oocytes. Theriogenol., 47: 183.
Bombatkar, R. 2008. Effect of ethylene glycol concentrations on survivability and in vitro maturation of vitrified-thawed immature buffalo (Bubalus bubalis) oocytes. M. V. Sc. Thesis submitted to Maharashtra animal and fishery sciences university, Nagpur.
Boni, R., L. Santella, B. Dale, S. Roviello, R. Di Palo, and V. Barbieri. 1992. Maturation in vitro of oocytes buffalo investigation ultrastructural (in Italian). Acta Medica Veterinaria 28: 153-161.
Bouquet, M., J. Selva and M. Auroux. 1993. Cryopreservation of mouse oocytes