b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
1.7. MỘT SỐ DẠNG TỔN THƯƠNG LẠNH CỦA TẾ BÀO TRỨNG
TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH
Đông lạnh tế bào trứng chưa thành thục, thành thục in vitro hoặc tế bào trứng đã rụng thường làm tổn thương hình thái và cấu trúc của chúng. Trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trải qua hai quá trình dễ bị tổn thương là giai đoạn tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh và giai đoạn đông lạnh-giải đông. Cơ chế chính gây ra những tổn thương lạnh là sự hình thành và tan của tinh thể đá nội bào. Tinh thể đá nội bào hình thành khi sự cân bằng giữa hai môi trường nội bào và ngoại bào của tế bào trứng bị phá vỡ trong quá trình khử nước trong quá trình đông lạnh (Parks và Ruffing, 1992; Muldrew và cs., 2004). Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra những tổn thương khác nhau đối với tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh. Những dạng tổn thương này bao gồm: tổn thương màng tế bào (vỡ màng, thủng màng, thay đổi tính chất của màng) (Shaw và cs., 2000; Mazur và Schneider, 1986).; màng sáng bị phá hủy (Neeta và Mital, 2009); hỏng sợi thoi vô sắc và tách NST gây ra dạng dị bội (Neeta và Mital, 2009); mất hoặc tăng số lượng NST (Shaw và cs., 2000); hỏng hoặc thay đổi trật tự ADN (Gasparrini và cs., 2009; 2006); tổn thương bộ khung xương tế bào (mất vi ống hoặc vi sợi actin) (Gautam và cs., 2011; Ciotti và cs., 2009; Aman và Parks, 1994); protein, enzyme bị mất nước hoặc mất chức năng quan trọng; cấu trúc tế bào trứng có thể bị thay đổi do sự thay đổi của các tế bào hạt vỏ, màng sáng (Shaw và cs., 2000).
Theo Ciotti và cs. (2009) mặc dù bản thân tế bào trứng cũng có khả năng tự sữa chữa một phần hoặc hoàn toàn sau quá trình đông lạnh-giải đông. Tuy nhiên đối với tế bào trứng trâu thì không có khả năng sửa chữa những tổn thương lạnh trên bộ khung xương tế bào (Aman và Parks., 1994).
1.8. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TRỨNG SAU ĐÔNG LẠNH – GIẢI ĐÔNG
Một yếu tố quan trọng trong việc nuôi trứng và thụ tinh in vitro đó là sử dụng đúng những tế bào trứng có khả năng thụ tinh. Như vậy, việc xác định được đúng tế bào trứng sống hay chết là rất cần thiết, nếu có thể, những tế bào trứng chết cần phải được loại bỏ trước khi đưa vào quá trình nuôi và thụ tinh. Có một vài phương pháp khác nhau được sử dụng để kiểm tra khả năng sống và mức độ tổn thương lạnh của tế bào trứng sau bảo quản lạnh. Có hai xu hướng chính để đánh giá đó là: dựa vào các chỉ số thông qua quan sát hình thái và nhuộm tế bào (sự giãn nở của tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng hay sự xuất hiện thể cực; nhiễm sắc thể; tế bào chất; màng sáng) hoặc dựa vào khả năng phát triển tiếp theo (thành thục, thụ tinh, phát triển của phôi).
1.8.1. Đánh giá chất lượng trứng dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế bào bào
Tiêu chuẩn chung điển hình thường sử dụng để đánh giá khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh - giải đông là sự có hoặc không có hiện tượng thoái hóa hoặc phân bố tế bào chất hoặc sự đứt gãy màng sáng. Sự tổn thương màng được đánh giá bằng cách thăm dò các chỉ tiêu biểu thị tính nguyên vẹn của màng sinh chất. Nhiều nghiên cứu hiện nay đã kiểm tra được sự nguyên vẹn của sợi thoi vô sắc. Thêm vào đó, tế bào trứng của động vật có vú cũng có thể được kiểm tra thông qua những phương pháp như là kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang, sự phát triển sinh học tiếp theo hoặc phân tích phân tử. Về đặc điểm cấu
trúc và chức năng, tế bào chết có những yếu tố khác biệt rất rõ ràng so với tế bào sống, đó là tính toàn vẹn của các cấu trúc bên trong tế bào, của nhân tế bào và màng tế bào. Những đặc điểm này có thể xác định được khi quan sát dưới kính hiển vi quang học đối pha. Ngoài ra có thể quan sát hình thái tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi hoặc nhuộm tế bào để đánh giá kỹ hơn các tổn thương của chúng sau đông lạnh-giải đông (Nguyễn Văn Hạnh và cs., 2013).
Về mặt hình thái thì tế bào trứng có khả năng sống sau đông lạnh-giải đông là tế bào trứng có hình cầu cân đối, không méo mó, lớp tế bào nang vẫn còn liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không bị tổn thương (không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc thoái hóa; màng sáng không bị đứt gãy. Tuy nhiên, những tế bào vừa mới chết hoặc đang trong quá trình chết thì lại khó phát hiện vì chúng chưa có những đặc điểm điển hình để dễ dàng phân biệt dưới kính hiển vi thông thường. Mặt khác, tế bào trứng có màng sáng dày vững chắc bảo vệ cho nên nó có thể tồn tại một thời gian dài mà không bị phá hủy. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã phát triển những phương pháp nhuộm tế bào hoặc các phương pháp gián tiếp để xác định những tế bào trứng không còn khả năng phát triển tùy theo mục đích. Với một số loại tế bào, có thể sử dụng chất nhuộm màu xanh methylen đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào. Do tính bán thấm của màng tế bào, tế bào sống sẽ không cho chất màu này đi qua do đó tế bào không bắt màu trong khi tế bào chết thì ngược lại. Tuy nhiên, với tế bào trứng đang trong quá trình chết hoặc mới chết thì phương pháp nhuộm này hầu như không xác định được. Muốn phát hiện được tế bào trứng không phát triển, có thể sử dụng các thuốc nhuộm nhân. Dựa vào cấu trúc của nhân ta có thể đánh giá được trạng thái hoạt động và giai đoạn phát triển của trứng. Tế bào trứng đang trong quá trình chết thì nhân thường bị biến dạng hoặc phân mảnh thậm trí không còn cấu trúc của nhân. Với tế bào trứng đang trong quá trình
thành thục, phương pháp nhuộm nhân cũng xác định được chúng đang ở giai đoạn nào của quá trình này, do đó có thể xác định được tỷ lệ sống – chết của các tế bào trứng trước hoặc sau bảo quản lạnh, đồng thời có thể xác định được giai đoạn phát triển và thành thục của tế bào trứng trong nuôi cấy in vitro. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu thường đánh giá hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng bằng cách kết hợp giữa quan sát hình thái với khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông. Nhờ đó sẽ loại trừ được tế bào trứng vừa mới chết hoặc đang trong trong quá trình chết mà chúng ta không phát hiện được khi quan sát bằng hình thái.
1.8.2. Đánh giá chất lượng dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của trứng
Hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng được đánh giá dựa trên sự thành thục in vitro trở lại, sự thụ tinh, phân chia và khả năng phát triển đến phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.
Tiêu chí đánh giá khả năng thành thục in vitro trở lại được áp dụng cho tế bào trứng đông lạnh ở giai đoạn chưa thành thục. Trứng chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông sẽ được nuôi thành thục in vitrio để hoàn thành quá trình thành thục nhân của mình. Sau nuôi, có thể sử dụng phương pháp nhuộm nhân hoặc quan sát hình thái để đánh giá tế bào trứng thành thục. Trứng hoàn thành quá trình thành thục khi nhân ở giai đoạn Metaphase II và xuất hiện thể cực thứ nhất. Khả năng thụ tinh, phân chia, phát triển đến phôi dâu, phôi nang cũng là tiêu chí được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng, áp dụng cho tế bào trứng được đông lạnh ở giai đoạn thành thục hoặc chưa thành thục. Đối với tế bào trứng được đông lạnh ở giai đoạn chưa thành thục, sau nuôi thành thục trở lại sẽ sử dụng phương pháp quan sát hình thái để lựa chọn những tế bào trứng có khả năng thành thục (tế bào trứng có các lớp tế
bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều) sử dụng cho quá trình thụ tinh và tạo phôi tiếp theo.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của quá trình thụ tinh như: môi trường thụ tinh (Abdoon và cs., 2001; Totey và cs., 1993, Suzuki và cs., 1992; Kandil và cs., 1999); chất lượng tinh trùng (Totey và cs., 1992; Madan và cs., 1994; Mustafa và cs., 1998; Kandil và cs., 1996; Totey và cs., 1993; Abbas 1998); việc loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng trong quá trình thụ tinh (Kandil và cs., 1999, Nandi và cs., 1998). Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo phôi in vitro từ tế bào trứng nói chung và tế bào trứng trâu đông lạnh nói riêng. Sự kết hợp những kỹ thuật nuôi thành thục in vitro, thụ tinh và nuôi in vitro của tế bào trứng đã được sử dụng thành công đối với việc tạo phôi trâu in vitro và nghé con (Madan và cs., 1996; Chauhan và cs., 1997a). Tuy nhiên do điều kiện nuôi cấy phức tạp và số lượng phôi nang thấp, chỉ đạt 8-10% tổng số tế bào trứng sau IVM; đã làm cho kỹ thuật này trở nên khó áp dụng (Palta và Chauhan, 1998). Theo Abdoon và cs. (2001); Kumar và cs. (2007) hiện nay môi trường nuôi phôi trâu in vitro sau thụ tinh gồm có: CR1aa; CR2aa; mSOFaa. Để nâng cao được tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang có thể bổ sung thêm huyết thanh (Wang và cs., 1997) hoặc tế bào ống dẫn trứng (Kumar và cs., 2007).
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Tế bào trứng trâu trong nghiên cứu này được thu từ buồng trứng trâu với nang trứng phân bố đều, trong và sáng màu, có nguồn gốc ở các lò mổ ở Đông Anh – Hà Nội, Vĩnh Tường – Vĩnh Phúc; Lim- Bắc Ninh. Trâu cho buồng trứng là trâu không bị bệnh tật và có đặc điểm của trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: kính hiển vi soi nổi Leica MZ6, kính hiển vi soi nổi Olympus SD 30, kính hiển vi vi thao tác Axiovert 40 CFL, kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axioplan S10, tủ nuôi tế bào động vật Heracell 150, bàn ổn nhiệt HT 50, máy khử ion Sartorius.
2.1.2.2. Hóa chất, dụng cụ
Hóa chất (xuất xứ Sigma): TCM 199, Ham,s F10, FCS, Phosphate buffer saline, Ethylene glycol, DMSO, Glycerol, PROH, sucrose, FSH, Penicillin, Streptomycin, Paraformaldehit, Propidium Iodide, RNAse, Bovine serum albumin, NaCl, KCl, CaCl2.2H2O, NaH2PO4.2 H2O, MgCl2.6H2O, NaHCO3, KH2PO4, Heparine, Sodium pyruvate, Sodium caffein Benzoate, dầu khoáng.
Dụng cụ vật tư tiêu hao: cọng rạ 0,25ml; cọng rạ hở, đĩa petri (Ф 90mm, Ф 35mm), pipette pasteur, xylanh 5ml, kim 18G, màng lọc 0,2μm; 0,45μm).
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng ở lò mổ. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi
3. Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi thành thục in vitro khác nhau.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu.
6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu
Buồng trứng trâu thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng trứng (PBS + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml), nhiệt độ 30 – 32oC, đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ. Rửa buồng trứng trâu trong dung dịch bảo quản buồng trứng vài lần ở nhiệt độ 30 – 32oC trước khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ
Thu trứng trâu từ những nang có đường kính 3-8mm trên buồng trứng bằng phương pháp chọc hút. Sử dụng xylanh 5ml với kim tiêm 18G, hút 0,5ml dung dịch thu trứng (PBS + huyết thanh thai bò (3%, v/v) + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml) vào trong xylanh trước khi chọc hút các nang trứng trên buồng trứng để pha loãng dịch nang trứng có chứa trứng hút được. Sau đó chuyển dịch nang trứng trong xylanh vào các đĩa Petri Ф 90mm, để lắng 5-10 phút trên bàn ổn nhiệt 37oC trước khi soi tìm trứng dưới kính hiển vi soi nổi.
2.3.3. Phân loại tế bào trứng
Các tế bào trứng sau khi soi tìm dưới kính hiển vi soi nổi sẽ được tiến hành đánh giá phân loại trên kính hiển vi soi nổi theo phân loại của Goodhand và cs. (2000). Hình thái tế bào trứng được mô tả ở mục 1.1.3.2.
2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân trứng trâu trứng trâu
Loại bỏ lớp tế bào nang của trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở nhiệt độ phòng; rửa lại bằng PBS, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở 37oC hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát xác định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang.
2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu
Thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a). Trứng trâu được rửa 2- 3 lần trong môi trường nuôi thành thục in vitro trước khi chuyển vào giọt môi trường nuôi (20 tế bào trứng/giọt; 100μl/giọt). Phủ kín các giọt nuôi bằng dầu khoáng và nuôi 24 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2, độ ẩm không khí bão hòa.
2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro
Sử dụng phương pháp quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào (mô tả ở mục 3.4.4) để đánh giá tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương pháp quan sát hình thái, tế bào trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là trứng với các lớp tế bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt chẽ. Trứng thành thục in vitro là trứng có nhân ở giai đoạn Metaphase II và xuất hiện thể cực thứ nhất.
2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro
2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng
Thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a) với dung dịch gốc BO (Brackett và Oliphant, 1975). Cọng rạ tinh trâu 0,25ml được lấy ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó để vào bể ổn nhiệt 37oC trong 20-25 giây. Rửa tinh trùng trâu đã giải đông trong dung dịch rửa tinh trùng (BO + Heparine
+ Caffeine), pha loãng bằng dung dịch pha loãng tinh trùng (BO + BSA) để mật độ tinh trùng đạt 2 x 106 tế bào/ml.
2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu
Tế bào trứng đã thành thục được rửa 2-3 lần trong dung dịch thụ tinh (BO + BSA + Sodium pyruvate + Caffeine sodium benzoate) trước khi chuyển vào giọt thụ tinh có tinh trùng đã được hoạt hóa (20 tế bào trứng/giọt) và được đồng nuôi cấy 18 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ ẩm không khí bão hòa.
2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro
Sau 18 giờ đồng nuôi cấy, loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh trứng trâu sau thụ tinh in vitro với pipet pasteur thủy tinh vô trùng trong môi trường nuôi phôi (mCR1aa + huyết thanh thai bò + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml). Tiếp theo rửa các tế bào trứng này 2-3 lần trong môi trường nuôi phôi in vitro và chuyển vào giọt nuôi chứa môi trường nuôi phôi in vitro.
Phủ kín các giọt nuôi bằng dầu khoáng và nuôi ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ ẩm không khí bão hòa. Kiểm tra tỷ lệ phân chia (thụ tinh) ở ngày thứ 2 sau thụ tinh; tỷ lệ phôi dâu và phôi nang ở ngày thứ 8-9 sau thụ tinh.
2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng
2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống
Để trứng trâu trong dung dịch trước cân bằng (pES): TCM 199 + 50% dung dịch đông lạnh (v/v) một thời gian trước khi chuyển sang dung dịch đông lạnh (VS): TCM 199 + chất bảo vệ lạnh + BSA + Sucrose. Tiếp theo nạp 5-6 trứng vào cọng rạ 0,25ml, hàn kín đầu và để trên hơi nitơ lỏng. Sau 2 phút các