b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân
trứng trâu
Loại bỏ lớp tế bào nang của trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở nhiệt độ phòng; rửa lại bằng PBS, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở 37oC hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát xác định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Loại bỏ lớp tế bào nang của trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở nhiệt độ phòng; rửa lại bằng PBS, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở 37oC hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát xác định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang. 3 lần trong môi trường nuôi thành thục in vitro trước khi chuyển vào giọt môi trường nuôi (20 tế bào trứng/giọt; 100μl/giọt). Phủ kín các giọt nuôi bằng dầu khoáng và nuôi 24 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2, độ ẩm không khí bão hòa.
2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro
Sử dụng phương pháp quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào (mô tả ở mục 3.4.4) để đánh giá tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương pháp quan sát hình thái, tế bào trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là trứng với các lớp tế bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt chẽ. Trứng thành thục in vitro là trứng có nhân ở giai đoạn Metaphase II và xuất hiện thể cực thứ nhất.
2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro
2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng
Thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a) với dung dịch gốc BO (Brackett và Oliphant, 1975). Cọng rạ tinh trâu 0,25ml được lấy ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó để vào bể ổn nhiệt 37oC trong 20-25 giây. Rửa tinh trùng trâu đã giải đông trong dung dịch rửa tinh trùng (BO + Heparine