b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng
thu được sau đông lạnh –giải đông
Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu của chúng tôi ở mỗi nhóm thí nghiệm dao động từ 84,66% đến 93,75% (Bảng 10). Kết quả này cũng phù hợp với Nowshari và cs. (1994); Men và cs. (2002); Atabay và cs. (2004). Theo các tác giả này thì tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông ở các loài khác nhau là từ 80% - 100%.
Việc mất tế bào trứng trong quá trình đông lạnh-giải đông cũng có một vài báo cáo đưa ra (Dhali và cs., 2000a; Luna và cs., 2001; Isachenko và cs., 2005b; Nguyễn Thị Thương Huyền và cs., 2012; 2014; Liang 2010). Có nhiều nguyên nhân như: tế bào trứng bị dính vào cọng rạ vì bề mặt cọng rạ rạn hoặc ghồ ghề (hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình giải đông) hoặc tế bào trứng bị tan rã trong quá trình đông lạnh.
Tỷ lệ tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông ở nhóm cọng rạ truyền thống là thấp nhất so với nhóm cọng rạ hở và vi giọt (tương ứng 84,66%; so với 93,75% và 90,32%; P<0,05); sự khác nhau giữa nhóm cọng rạ hở và vi giọt là không có ý nghĩa (P>0,05). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với báo cáo của Hammam và El-Shahat (2005), Misha và cs. (2012), Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. (2014).
Bảng 10: Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông
Phương pháp Số tế bào trứng đông lạnh
Tế bào trứng thu được sau đông lạnh- giải đông
Số tế bào trứng % (M ± SE)
Cọng rạ truyền thống 378 320 84,66b ± 2,84
Cọng rạ hở 368 345 93,75a ± 1,44
Vi giọt 372 336 90,32a ± 2,32
Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
Trong quá trình đông lạnh – giải đông cọng rạ truyền thống dễ bị nổ, vỡ hoặc rạn nứt do sự thay đổi áp suất khi chúng được nhúng ngập trong nitơ lỏng hoặc bể ấm (giải đông). Nguyên nhân có thể là do thành cọng rạ dày nên cọng rạ dễ bị vỡ và mất mẫu trong quá trình đông lạnh – giải đông. Sự thay đổi áp suất trong cọng rạ khi được nhúng ngập trong nitơ lỏng trong quá trình đông lạnh hoặc khi đưa vào bể ấm 37oC trong quá trình giải đông có thể làm cho cọng rạ bị
nứt hoặc vỡ. Để hạn chế được điều này, trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống cọng rạ trước khi được nhúng ngập thẳng vào trong nitơ lỏng sẽ được để trên hơi nitơ lỏng ; hoặc trong quá trình giải đông trước khi chuyển cọng rạ vào bể ấm 37oC cọng rạ sẽ được để trong không khí 5-10 giây. Tuy nhiên do sự thay đổi nhiệt độ của hơi nitơ lỏng và không khí xung quanh mà vẫn xảy ra hiện tượng nổ, vỡ hoặc rạn nứt cọng rạ trong quá trình giải đông.
Kết quả ở bảng 10 cho thấy tỷ lệ thu hồi tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông ở nhóm cọng rạ hở là cao hơn so với nhóm cọng rạ truyền thống và vi giọt. Kết quả này là phù hợp với báo cáo của Sharma và cs. (2010). Theo các tác giả này, tỷ lệ thu hồi tế bào trứng sau đông lạnh - giải đông ở phương pháp đông lạnh bằng cọng rạ hở là cao hơn cọng rạ truyền thống trong cả hai trường hợp sử dụng chất bảo vệ lạnh Ethylene glycol hoặc Propylene glycol. Tuy nhiên tỷ lệ tế bào trứng thu hồi sau đông lạnh – giải đông của các tác giả này (98,04%) là cao hơn so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi (93,75%).
Sự khác nhau giữa kết quả nghiên cứu có thể là do Sharma và cs. (2010) sử dụng tế bào trứng trâu thành thục, còn trong nghiên cứu này, tôi sử dụng tế bào trứng trâu chưa thành thục để đông lạnh. Mặc dù vậy, tỷ lệ thu tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông của chúng tôi trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở (93,75%) là cao hơn so với Hammam và El-Shahat (2005) (70,0%), Misha và cs. (2012) (81,35%) khi cùng sử dụng cọng rạ hở làm vật chứa mẫu. Sự khác nhau này có thể là do việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau trong quá trình đông lạnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Ethylene glycol là chất bảo vệ lạnh, trong khi đó Hammam và El-Shahat (2005) sử dụng Glycerol, Misha và cs. (2012) sử dụng hỗn hợp Ethylene glycol và DMSO là chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông lạnh.