4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1.5.1.Bảo quản lạnh tế bào trứng
Quá trình bảo quản lạnh tế bào hoặc mô là cho chúng tiếp xúc với nhiệt độ giảm dần đến -1960C, nhiệt độ của nitơ lỏng. Ở nhiệt độ thấp, nước tồn tại ở trạng thái rắn, các hoạt động sinh học sẽ ngừng lại và chức năng của tế bào sẽ được lưu giữ hàng thế kỷ. Do tế bào trứng có khả năng thấm màng thấp đối với các chất bảo vệ lạnh thấm màng nên bảo quản lạnh tế bào trứng là khó hơn so với bảo quản lạnh tinh trùng hoặc phôi. Tế bào trứng ở động vật có vú có thể tích lớn hơn 3-4 lần so với tinh trùng, hàm lượng lipid trong tế bào chất cao, do đó làm giảm đáng kể tỷ lệ thể tích bề mặt được tiếp xúc và làm cho chúng trở nên nhạy cảm với những tổn thương lạnh và dễ bị hình thành tinh thể đá nội bào trong quá trình đông lạnh (Toner và cs., 1990; Ruffing và cs., 1993; Arav và cs., 1996; Zeron và cs., 1999).
Tế bào trứng được bao xung quanh bởi màng sáng, nó đóng vai trò như hàng rào bảo vệ ngăn cản chuyển động của nước, sự thẩm thấu và thẩm xuất của chất bảo vệ lạnh đối với tế bào trứng (Joseph Saragusty và Amir Arav, 2011). Sau giải đông màng sáng bị hóa rắn làm cho tinh trùng khó xâm nhập trong quá trình thụ tinh (Mavrides và Morroll, 2005). Điểm khác nhau chính để làm nên sự thành công của quá trình bảo quản lạnh giữa tế bào trứng và phôi là màng tế bào chất, sự có mặt của các tế bào hạt vỏ, sự hình thành thoi vô sắc ở giai đoạn thành thục nhân (MII) của quá trình giảm phân. Quá trình đông lạnh sử dụng hợp chất khử nước, điểm đông lạnh thấp, đông lạnh chậm và thủy tinh hóa nội bào giúp cho tế bào trứng tránh khỏi những tổn thương lạnh. Hiện nay chưa có một phương pháp chung chắc chắn nào được thiết lập để bảo quản lạnh tế bào trứng của một số loài, mặc dù đã có một vài quy trình đông lạnh tạo ra được con non từ trứng sau đông lạnh-giải đông như ở bò, cừu, ngựa.
Tế bào trứng có khả năng sống ở 37oC và không có hoạt động sinh học nào diễn ra tại -196oC; thời điểm nguy hiểm nhất xảy ra trong quá trình bảo quản lạnh là giai đoạn chuyển đổi nhiệt độ từ nhiệt độ lạnh xuống -196oC và giai đoạn giải đông tiếp theo đến 37oC. Tế bào trứng có những cấu tạo đặc biệt và rất nhạy cảm với nhiệt độ hiệu quả của quá trình đông lạnh tế bào trứng thường bị ảnh hưởng bởi điều này. Mazur (1977) đã mô tả những hiện tượng vật lý chính xảy ra trong quá trình đông lạnh tế bào. Theo tác giả này, khi nhiệt độ hạ xuống -5°C; tế bào và môi trường xung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá (supercooling), và sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh. Tinh thể nước sẽ hình thành bên ngoài nhiệt độ -5°C đến -15°C (do ngẫu nhiên hay do tạo mầm đá-seeding), nhưng lúc này các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ lạnh chưa tạo đá do có sự ngăn cản lan việc lan rộng của tinh thể nước vào trong tế bào chất. Theo định nghĩa, nước ở nhiệt độ lạnh chưa
tạo đá bên trong tế bào có nồng độ hóa học cao hơn so với nước trong dung dịch được đông lạnh một phần bên ngoài tế bào. Để đáp ứng lại sự chênh lệch này nước sẽ đi ra ngoài tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào. Khi nước chuyển từ dạng dung dịch sang dạng đá, các chất hòa tan trong dung dịch sẽ không bị hóa rắn, đây là lý do điểm đông lạnh của những dung dịch có chứa chất hòa tan bị giảm xuống. Khi nhiệt độ giảm xuống và hình thành thể rắn, nồng độ các chất hoàn tan và điện giải trong dung dịch đông lạnh có thể tăng lên (Lovelock, 1954). Nồng độ này có thể gây độc cho protein tế bào, ảnh hưởng đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào; vì vậy việc loại trừ những ảnh hưởng của dung dịch là một trong những mục tiêu quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá trình bảo quản lạnh (John và cs., 2006).
Trong suốt quá trình giải đông, tinh thể đá sẽ tan ra và giải phóng nước, kết quả làm giảm áp suất thẩm thấu của dung dịch xung quanh. Khi quá trình giải đông diễn ra chậm, nước có thể hóa rắn trở lại và gây nguy hiểm cho tế bào. Khi quá trình giải đông diễn ra nhanh, áp suất thẩm thấu ngoại bào bị giảm đột ngột do sự tan chảy nhanh chóng của tinh thể đá ngoại bào có thể dẫn đến sự thay đổi nhanh chóng của nước ra và vào bên trong tế bào, dẫn đến hiện tượng tế bào bị phồng lên và tổn thương (Mazur. 1980). Hiện tượng này được gọi là shock thẩm thấu và việc loại trừ nó cũng là mục tiêu để đảm bảo cho sự thành công của quá trình bảo quản lạnh (John và cs., 2006).
1.5.2. Sự khử nước (dehydration) trong quá trình đông lạnh tế bào trứng
Việc khử nước của tế bào trứng xảy ra trong quá trình đông lạnh là điều cần thiết để đảm bảo khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông. Do tế bào trứng có tỷ lệ thể tích bề mặt thấp nên chúng sẽ rất khó thực hiện sự khử nước trong quá trình đông lạnh – giải đông. Yếu tố đầu tiên đem lại sự thành công cho quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng chính là việc tế bào trứng khử
nước thành công trong quá trình này. Mỗi loại tế bào có khả năng thấm màng cơ bản và đặc trưng riêng (Leibo, 1980). Theo Oda và cs. (1992); Agca và cs. (2000) thì stress thẩm thấu là một trong những nguyên nhân gây bất lợi cho khả năng phát triển của tế bào trứng.
Mặc dù đã có sự quan tâm nghiên cứu đến tính thấm của nước qua màng tế bào trứng và phôi nhưng hầu hết mới chỉ thực hiện ở trên chuột (Leibo, 1980; Toner và cs., 1991; Oda và cs., 1992; Pedro và cs., 1997). Khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cũng đã được kiểm tra trên một số tế bào trứng của động vật nuôi như dê (Le Gal và cs., 1994); bò (Ruffing và cs., 1993; Agca và cs., 2000) và cả ở trên người (Trad và cs., 1998). Trong quá trình đông lạnh tế bào trứng sẽ được cho vào môi trường có chứa chất bảo vệ lạnh với một nồng độ nhất định. Các tế bào trứng được tiếp xúc 1 bước hoặc nhiều bước với chất bảo vệ lạnh tùy thuộc vào quy trình đông lạnh. Dung dịch đông lạnh có thể sử dụng chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng để tạo nên sự thay đổi trong nước đẳng trương giữa nội và ngoại bào dẫn tới hiện tượng nước thoát ra khỏi tế bào. Quá trình này được gọi là sự khử nước tế bào, đây cũng là một bước cần thiết và quan trọng trong cân bằng đông lạnh. Thủy tinh hóa là một phương pháp đông lạnh không cân bằng trong đó sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao; chính vì thế cần phải có những nghiên cứu để giảm thiểu tác động của stress thẩm thấu đến tế bào trứng, qua đó nâng cao được hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng.
1.5.3. Quá trình cân bằng
Trong các quy trình đông lạnh nồng độ chất bảo vệ lạnh thường từ 1M đến 8M, với mục đích làm tăng nồng độ bên ngoài tế bào. Để làm giảm những yếu tố ảnh hưởng bất lợi cho khả năng thẩm thấu của tế bào trứng trong quá trình đông lạnh, việc cho tế bào trứng tiếp xúc từng bước với chất bảo vệ lạnh là cần thiết. Các quá trình cân bằng một bước hoặc nhiều bước ở nhiệt độ phòng được sử
dụng hiện nay dựa trên sự tính toán về dạng và nồng độ cuối cùng của chất bảo vệ lạnh. Thêm vào đó, thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh cũng là một nhân tố quan trọng khác đối với việc điều chỉnh sự xâm nhập của chất bảo vệ lạnh vào trong tế bào chất. Đối với Glycerol, tối thiểu là 20 phút để hoàn thành quá trình xâm nhập vào bên trong tế bào trứng thông qua màng sáng và màng tế bào chất. EG và PROH đòi hỏi thời gian thẩm thấu thông qua màng tế bào ít hơn Glycerol, và thời gian cân bằng không cần thiết phải lâu hơn 10 phút. Việc sử dụng kết hợp chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng cũng làm tăng hiệu quả của quá trình đông lạnh, vì chất bảo vệ lạnh không thấm màng có tác dụng ngăn chặn sự xâm nhập thừa của một vài chất bảo vệ lạnh thấm màng.
1.5.4. Tốc độ đông lạnh
Tốc độ đông lạnh là một trong những yếu tố quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá trình bảo quản lạnh. Theo Le Gal và Massip. (1999) tốc độ đông lạnh nhanh là chìa khóa mở ra sự thành công của quá trình đông lạnh tế bào trứng theo phương pháp thủy tinh hóa. Tốc độ đông lạnh nhanh làm giảm thời gian tiếp xúc của tế bào trứng với nhiệt độ đồng thời giảm độc tố của chất đông lạnh, nhờ đó sẽ giảm bớt các tổn thương của tế bào trứng trong quá trình thủy tinh hóa. Tốc độ đông lạnh phụ thuộc vào vật chứa mẫu, khối lượng, độ dẫn nhiệt và thành phần dung dịch… (Yavin và Arav., 2007). Theo Arav và cs. (2002); Yavin và Arav (2007) nếu thể tích chứa mẫu đông lạnh nhỏ sẽ làm tăng khả năng sống sau đông lạnh-giải đông của mẫu đông lạnh. Bởi vì khi thể tích chứa mẫu đông lạnh nhỏ sẽ cho phép khả năng truyền nhiệt tốt hơn, và tốc độ đông lạnh tăng lên. Ví dụ khi sử dụng một dụng cụ chứa mẫu là cọng rạ hở, có thể làm cho tốc độ đông lạnh đạt được đến 20000oC/phút.
Việc tăng tốc độ đông lạnh-giải đông trong quá trình bảo quản lạnh sẽ giúp cho tế bào tránh được những tổn thương lạnh, làm giảm nồng độ chất bảo quản
lạnh, nhờ đó các tế bào sẽ vượt qua vùng nhiệt độ giới hạn (-5 đến -15oC) một cách nhanh chóng, nước đi ra ngoài tế bào và đông lạnh ở bên ngoài. Điều này ngăn chặn tổn thương lạnh đối với các giọt lipid nội bào, lipid có trong màng tế bào và bộ khung xương tế bào. Mức độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ này phải trên tốc độ giới hạn. Đối với mỗi loại tế bào có một tốc độ giới hạn cho phép khác nhau. Cùng với mức độ mất nước là khả năng tạo băng đá nội bào cũng tăng lên gây tổn thương cho tế bào do đông lạnh hoặc giải đông. Nếu tốc độ đông lạnh ở dưới giới hạn cho phép thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, đồng thời nồng độ chất hòa tan cũng tăng lên ở bên ngoài tế bào.
Các hiện tượng vật lý xảy ra bên trong tế bào trứng trong quá trình đông lạnh-giải đông phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh. Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hóa học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hóa học ngoại bào. Điều này dẫn tới việc là tế bào bị mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào. Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh thì nó không có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng, nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên và xảy ra hiện tượng đông lạnh nội bào. Như vậy sự hiện diện của tinh thể đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu thay đổi theo tốc độ đông lạnh để quyết định đến khả năng sống của tế bào trứng sau bảo quản lạnh-giải đông.
1.5.5. Phương pháp đông lạnh
Từ khi có báo cáo đầu tiên về bảo quản lạnh thành công phôi chuột ở giai đoạn 8 tế bào (Whittingham và cs., 1972), nhiều nghiên cứu tiếp theo được thực hiện để kiểm tra các yếu tố có liên quan đến khả năng sống sau đông lạnh - giải đông của phôi và tế bào trứng động vật có vú để xem xét hiệu quả và khả năng
phát triển tiếp theo của chúng. Hiện nay trên thế giới đang tồn tại song song hai phương pháp bảo quản lạnh là đông lạnh chậm (slow-freezing), thủy tinh hóa (vitrification). Thủy tinh hóa bao gồm thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing) tùy thuộc vào tốc độ đông lạnh, các chất bảo vệ lạnh, vật chứa mẫu đông lạnh. Điều khác biệt cơ bản giữa hai phương pháp này là nồng độ chất bảo vệ lạnh, tốc độ đông lạnh, vật chứa mẫu. Hầu hết các tế bào trứng được bảo quản lạnh theo một trong hai quy trình: (1) cân bằng đông lạnh, thường được gọi là đông lạnh chậm và (2) không cân bằng đông lạnh, thường gọi là đông lạnh nhanh hoặc đông lạnh cực nhanh.
1.5.5.1. Đông lạnh chậm (slow-freezing)
Đây là phương pháp áp dụng thành công đầu tiên cho việc bảo quản lạnh tế bào trứng/phôi của động vật có vú. Cơ chế của đông lạnh chậm là tạo tinh thể đá ngoại bào và ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào. Các chất bảo vệ lạnh thấm màng có thể đi vào bên trong tế bào trứng và khử nước của tế bào trứng (Liang, 2010). Nguyên tắc của phương pháp này là tạo ra sự kết tinh nước trong nội bào một cách chậm và có kiểm soát. Nước được đi ra hay đi vào tế bào nhờ vào độ nhớt hoặc sự hóa rắn mà không có sự hình thành tinh thể đá nội bào. Đông lạnh chậm kiểm soát tốc độ đông lạnh ở mức 0,3 -0,5oC/phút, vì vậy nước nội bào có thể đủ thời gian đi ra khỏi tế bào trứng. Đông lạnh chậm là đòi hỏi tốc độ đông lạnh chậm và dài trước khi mẫu được chuyển vào nitơ lỏng. Đó là phương pháp cân bằng truyền thống khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh thấm màng. Phương pháp này gồm có việc sử dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ thấp (1-2M) với quá trình khử nước diễn ra từ từ để đáp ứng dần với nồng độ của các phần đông lạnh ngoại bào trong suốt quá trình hình thành tinh thể đá nội bào đồng thời duy trì sự cân bằng giữa các nhân tố làm ảnh hưởng đến sự tổn thương tế bào.
Phương pháp đông lạnh chậm gồm các bước sau:
- Tế bào trứng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp ở nhiệt độ phòng tới khi đạt được sự cân bằng giữa dung dịch chất bảo vệ lạnh và tế bào trứng. Tế bào trứng sau đó được nạp vào cọng rạ.
- Cọng rạ được cho vào máy đông lạnh và được làm lạnh ở nhiệt độ -5 đến -7oC, tại đây chúng được giữ vài phút để cân bằng. Sau khi cân bằng dung dịch sẽ được tạo mầm đá để bắt đầu quá trình đông lạnh nội bào với tốc độ đông lạnh khoảng 0,3-0,5oC/phút, để đảm bảo nhiệt độ đồng đều trong mẫu cho tới khi đạt đến -65oC. Lúc này nồng độ chất bảo vệ lạnh trong nội bào đủ cho nước nội bào hóa rắn mà không hình thành tinh thể đá nội bào. Khi đó cọng rạ chứa mẫu được nhúng ngập vào trong nitơ lỏng để bảo quản cho tới khi sử dụng.
Trong phương pháp đông lạnh chậm, tinh thể nước đá được tạo ra ở nhiệt độ 6oC bằng cách tạo mầm đá, sự hình thành tinh thể đá nhỏ này sẽ cho phép hình thành tiếp các tinh thể đá khác. Mầm đá thường được thực hiện bằng cách dùng một dụng cụ rất lạnh (chẳng hạn như cái kẹp) chạm vào bên ngoài của vật chứa mẫu để tạo ra một tinh thể đá nhỏ hình thành bên ngoài vùng chứa mẫu bảo quản lạnh. Kết quả của sự hình thành đá là giải phóng ra năng lượng thường được gọi là phản ứng tổng hợp nhiệt. Do đó, dung dịch thường được giữ ở nhiệt độ này trong một thời gian, khoảng 10-30 phút để cân bằng. Sự phát triển các tinh thể đá sẽ làm tách các chất hòa tan khỏi nước, do đó dần tăng nồng độ của chúng trong dung dịch còn lại. Chính vì thế, mầm đá phải được thực hiện ở vị trí