b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả
lạnh tế bào trứng trâu
Từ kết quả của mục 3.4.1; 3.4.2 và 3.4.3; thí nghiệm này được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis dựa trên cơ sở sử dụng chất bảo vệ lạnh thấm màng EG ở nồng độ 6M, tiếp xúc 2 bước với thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút. Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro
trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông. Kết quả thể hiện ở bảng 9.
Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu không chỉ phụ thuộc vào quá trình đông lạnh mà còn phụ thuộc vào quá trình giải đông.
Bảng 9: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi giải đông trong dung dịch có hoặc không có Sucrose
Giải đông Số tế bào trứng không đông lạnh nuôi thành thục Số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông
lạnh-giải đông Tế bào trứng thành thục Số tế bào trứng % (M ± SE) Không sucrose 209 64 30,62c ± 0,45 Có sucrose 192 78 40,63b ± 0,44 Đối chứng (Tế bào trứng không đông lạnh) 209 156 74,64a ± 1,76
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 9 cho thấy việc sử dụng sucrose như là chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông có hiệu quả hơn khi không sử dụng sucrose. Tỷ lệ tế bào trứng trâu chưa thành thục có khả năng sống và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh giải đông của nhóm có sucrose
là cao hơn nhóm không sucrose (tương ứng: 40,63% và 30,62%; P<0,05; Hình 8). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Karima và cs. (2010); theo họ thì tỷ lệ thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục ở nhóm thêm đường Galactose là cao hơn so với nhóm không thêm Galactose.
Hình 7: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị vỡ màng sáng sau giải đông (độ phóng đại 40 lần)
Sucrose là chất bảo vệ lạnh không thấm màng thường được sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng hoặc phôi. Trong môi trường đông lạnh hoặc giải đông chúng hỗ trợ cho sự ổn định cấu trúc màng tế bào. Trong quá trình thủy tinh hóa, succrose có bản chất là đại phân tử nên chúng có thể tạo nên gradien nồng độ thông qua màng tế bào; nhờ đó giúp cho quá trình khử nước nội bào của tế bào xảy ra hoàn thiện hơn. Thêm vào đó sucrose hoạt động giống như đệm thẩm thấu để giảm shock thẩm thấu và những ảnh hưởng bất lợi của chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng trong quá trình giải đông, qua đó giúp cho quá trình đông lạnh – giải đông đạt được sự thành công.
Theo Kuleshova và cs. (2001) thì nồng độ các chất bảo vệ lạnh thẩm thấu qua màng tế bào có thể thấp nhưng vẫn đảm bảo được hàm lượng các chất bảo vệ lạnh trong dung dịch thủy tinh hóa vì chúng được thay thế bởi các chất bảo vệ lạnh không thấm màng. Toth và cs. (1994) cũng báo cáo rằng tỷ lệ thành thục của tế bào trứng người chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông được cải thiện với sự có mặt của đường trong dung dịch đông lạnh.
Quá trình giải đông là một phần đảm bảo cho sự thành công của quy trình thủy tinh hóa, trong đó chất bảo vệ lạnh không thấm màng đóng vai trò rất quan
trọng trong quá trình giải đông. Trong suốt quá trình giải đông, nước được tạo ra bởi sự tan chảy của đá một cách nhanh chóng dẫn đến sự giảm áp suất thẩm thấu nội bào. Shock thẩm thấu có thể xảy ra nếu chất bảo vệ lạnh trong nội bào không thể khuếch tán ra ngoài một cách nhanh chóng đủ để ngăn chặn sự tràn vào của nước tự do, dẫn đến sự gẫy vỡ tế bào (Hình 7). Sự có mặt của các chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong dung dịch giải đông sẽ nâng cao được hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi.
Thêm vào đó việc cho tế bào trứng trâu sau giải đông vào dung dịch có nồng độ sucrose ban đầu cao, tiếp theo là chuyển sang dung dịch có chứa nồng độ sucrose thấp hơn là cần thiết. Bằng cách này các tế bào trứng được chuyển trực tiếp từ dung dịch có chứa các chất bảo vệ lạnh vào dung dịch sucrose đẳng trương với các chất bảo vệ lạnh. Nhờ vào tính không thấm màng của mình, sucrose hỗ trợ quá trình loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh thấm màng ra khỏi tế bào trứng, đồng thời giúp cho tế bào trứng không bị tổn thương về mặt cấu trúc (co rút hoặc sưng phồng) trong quá trình giải đông.
Hình 8: Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông sau nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)
Hình 9: Tế bào trứng trâu đầm lầy bị tan rã lớp tế bào nang bao xung quanh sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)
Mặc dù có sự cải thiện về tỷ lệ thành thục khi sử dụng chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông nhưng kết quả vẫn thấp hơn so với đối chứng (tương ứng 40,63% so với 74,64%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào trứng chưa thành thục, sự thành thục trở lại của tế bào trứng sau đông lạnh giải đông bị ảnh hưởng bởi quá
trình đông lạnh – giải đông. Quá trình này gây ra những tác động bất lợi cho sự thành thục nhân và tế bào chất, đặc biệt là các tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng (Trounson, 1992). Các tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng chưa thành thục có vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dưỡng chất phục vụ cho quá trình trao đổi chất và thành thục nhân của tế bào trứng (Down và cs., 1988; Pawshe và Totey., 1993). Nếu các tế bào nang bị tan rã sau đông lạnh - giải đông thì tế bào trứng sẽ không thể hoàn thành được quá trình thành thục nhân và tế bào chất của mình (Hình 9).
Kết quả được nêu ra ở mục 3.4.1; 3.4.2; 3.4.3; 3.4.4 của nghiên cứu này cho thấy chất bảo vệ lạnh thấm màng Ethylene glycol có hiệu quả tốt hơn