b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế
Việc sử dụng riêng lẻ Ethylene glycol ở nồng độ 6M và cách thức tiếp xúc 2 bước, thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút, kết hợp cùng với sucorose trong quá trình giải đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho tế bào trứng trâu đầm lầy trong nghiên cứu này.
3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu trứng trâu
Có nhiều nguyên nhân làm giảm sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng như: sự hình thành tinh thể đá, các dạng tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo vệ lạnh (Liebermann và cs., 2002). Yếu tố sinh lý chính gây nên sự đứt gãy tế bào trong suốt quá trình đông lạnh – giải đông bao gồm: sự hình thành tinh thể đá (Mazur và cs., 2005) và tổn thương do áp suất thẩm thấu (Pedro và cs., 1997). Tuy nhiên những yếu tố này có thể được giảm thiểu bằng những kỹ thuật bảo quản lạnh như phương pháp đông lạnh.
Theo Smorag và Gajda (1994); Vajta và Kuwayama (2006) trong suốt quá trình thủy tinh hóa, sự hình thành tinh thể đá có thể được ngăn chặn nhờ vào tốc
độ đông lạnh-giải đông, nồng độ cao của chất bảo vệ lạnh trong dung dịch thủy tinh hóa. Phương pháp thủy tinh hóa sử dụng tốc độ đông lạnh-giải đông nhanh do đó không chỉ ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá mà nó còn giúp cho tế bào trứng có thể vượt qua vùng nhiệt độ nguy hiểm một cách nhanh chóng (15oC đến – 5oC), nước sẽ đi ra ngoài tế bào và đông lạnh ở bên ngoài. Điều này giúp màng tế bào và bộ khung xương tế bào không phải chịu những tổn thương lạnh.
Dụng cụ chứa mẫu trong các phương pháp thủy tinh hóa thường sử dụng cọng rạ truyền thống 0,25ml. Vì cọng rạ truyền thống là tương đối nhỏ (đường kính bên ngoài 2,0mm; chiều dài 13cm), nên khi nó được nhúng ngập trực tiếp trong nitơ lỏng và giải đông thì tốc độ đông lạnh-giải đông đạt > 2500oC/phút (Kuleshova và Shaw, 2000). Tốc độ đông lạnh-giải đông này là nhanh so với phương pháp đông lạnh chậm truyền thống. Tuy nhiên đối với những tế bào nhạy cảm với quá trình đông lạnh như tế bào trứng thì vẫn bị một số tổn thương nhất định. Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã tìm cách tăng tốc độ đông lạnh-giải đông thông qua việc giảm thiểu lượng dung dịch và vật chứa mẫu. Phương pháp bảo quản lạnh này được một số nhà nghiên cứu đưa ra và gọi là đông lạnh cực nhanh (Purohit và cs., 2012).
Đông lạnh cực nhanh và thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống đều sử dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ cao và thời gian tế bào trứng tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh ngắn. Điểm khác biệt lớn nhất giữa hai phương pháp này chính là vật chứa mẫu và thể tích dung dịch chứa mẫu đông lạnh. Hiện nay có một số cách thức đông lạnh cực nhanh được sử dụng như là: cọng rạ hở (Sharma và Purohit, 2008); cryotop (Kuwayama và cs., 2005; Nguyễn Văn Hạnh và cs., 2013), vi giọt (Landa và Tepla, 1990; Liang và cs., 2012).... Mỗi nhóm kỹ thuật đều có những ưu điểm riêng của mình. Thiết kế của thiết bị chứa mẫu và dung dịch bảo quản lạnh ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh-giải đông.
Trong phương pháp cọng rạ hở, do lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa có chứa mẫu được giảm thiểu (1-1,5μl), thêm vào đó độ dày của thành cọng rạ khá mỏng nên nó làm tăng đáng kể tốc độ đông lạnh-giải đông. Tốc độ đông lạnh-giải đông của phương pháp cọng rạ hở vào khoảng 22500oC/phút trong khi ở phương pháp thủy tinh hóa cọng rạ truyền thống tốc độ này là 2500oC/phút. Tốc độ giải đông nhanh cũng rất quan trọng để ngăn chặn những tổn thương tại thời điểm giải đông (Isachenko và cs., 2005a; Isachenko và cs., 2005b; Seki và Mazur, 2008). Ngoài ra do cấu tạo của vật chứa mẫu trong phương pháp đông lạnh bằng cọng rạ hở mà quá trình thủy tinh hóa cũng như quá trình nạp và trục xuất tế bào trứng ra khỏi cọng rạ hở có thể dễ dàng được quan sát bằng mắt thường hoặc dưới kính hiển vi.
Bên cạnh việc giảm thiểu lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa xung quanh tế bào trứng, các nhà nghiên cứu đã thiết lập một mối liên hệ trực tiếp (không có lớp nhiệt cách điện) giữa dung dịch thủy tinh hóa và nitơ lỏng với mục đích tăng tốc độ đông lạnh. Phương pháp đông lạnh này được gọi là thủy tinh hóa vi giọt. Phương pháp vi giọt cũng làm tăng đáng kể tốc độ đông lạnh-giải đông do tế bào trứng được tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng và thể tích tối thiểu của dung dịch thủy tinh hóa có chứa mẫu được giảm thiểu (5-20μl).
Phương pháp cọng rạ hở, thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, vi giọt đều sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao cùng với thiết bị bảo quản lạnh khác nhau. Tuy nhiên do ở phương pháp đông lạnh bằng cọng rạ hở và vi giọt sử dụng dụng cụ chứa dung dịch thủy tinh hóa có mẫu là hở, lại tiếp xúc trực tiếp với dung dịch nitơ lỏng nên dễ dẫn đến sự nhiễm khuẩn trở lại ở quá trình nuôi tiếp theo sau đông lạnh-giải đông (Tedder và cs., 1995; Fountain và cs., 1997). Ngược lại mặc dù tốc độ đông lạnh-giải đông là không cao bằng phương pháp cọng rạ hở và vi giọt nhưng thiết bị chứa mẫu của phương pháp thủy tinh hóa
trong cọng rạ truyền thống là kín nên hạn chế được sự nhiễm khuẩn sau đó. Để giải quyết được vấn đề này, có thể lọc bỏ nitơ lỏng bằng màng lọc vô trùng nhưng điều này làm cho quá trình đông lạnh trở nên phức tạp và khó thực hiện (Vajta và cs., 1998a; Lane và cs., 1999).
Để đánh giá được ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ba phương pháp đông lạnh đang được sử dụng rộng rãi trong bảo quản lạnh tế bào trứng là: thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa bằng vi giọt và thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở. Hiệu quả của ba phương pháp đông lạnh: thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở và thủy tinh hóa vi giọt được đánh giá dựa trên số lượng, chất lượng và khả năng phát triển in vitro
tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông.