4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1.5.5.2. Thủy tinh hóa (Vitrification)
Thủy tinh hóa là một quy trình vật lý mà theo đó dung dịch chuyển sang dạng ổn định như thủy tinh bằng cách làm lạnh nhanh chóng nhưng không có sự hình thành tinh thể đá (Fahy và cs., 1984; Vajta và cs., 2009). Phương pháp đông lạnh thủy tinh hóa là cách tiếp cận tối ưu vì có thể tránh được tổn thương lạnh và sự hình thành tinh thể đá. Thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xảy ra rất nhanh. Sự thành công của quá trình thủy tinh hóa phụ thuộc vào hai yếu tố: nồng độ cao của chất bảo vệ lạnh để ức chế sự hình thành tinh thể đá và tốc độ đông lạnh-giải đông (có thể lên đến 20000oC/phút) để nhanh chóng đi qua vùng nhiệt độ nguy hiểm, tránh cho tế bào khỏi những tổn thương lạnh. Do các chất bảo vệ lạnh thường có độc tính nhất định đối với tế bào nên thời gian tiếp xúc đối với tế bào trứng/phôi phải càng ngắn càng tốt.
Hiện nay quy trình phổ biến cho thủy tinh hóa tế bào trứng/phôi thường được bắt đầu bằng việc cho chúng cân bằng trong dung dịch có chứa nồng độ
chất bảo vệ lạnh thấp hơn (được gọi là dung dịch trước cân bằng, pES) trước khi chuyển chúng vào dung dịch cuối cùng (gọi là dung dịch thủy tinh hóa, VS) có chứa nồng độ cao chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng chẳng hạn như đường hoặc một đại phân tử. Dung dịch pES chứa từ 25 đến 50% (thường là 50%) nồng độ chất bảo vệ lạnh thấm màng cuối cùng và có thể được thêm để tăng nồng độ, ví dụ 25% và sau đó là 50% nồng độ chất bảo vệ lạnh thấm màng.
Thời gian trước cân bằng thường được giới hạn 1-3 phút, tuy nhiên có thể sử dụng thời gian trước cân bằng dài (5-15 phút) với nồng độ chất bảo vệ lạnh thấp trong dung dịch pES (Dinneys và cs., 2000; Gupta và cs., 2007; Kuwayama và cs., 2005). Ngược lại thời gian trong dung dịch VS được giới hạn 25-45 giây. Do nồng độ các chất bảo vệ lạnh trong dung dịch VS là khá cao cho nên chúng sẽ gây độc cho tế bào trứng, vì vậy thời gian tế bào ở trong dung dịch này cần phải được giảm xuống. Việc tăng thời gian trong dung dịch VS sẽ làm tăng độc tố của chất bảo vệ lạnh nhưng điều này có thể giúp bảo vệ tế bào trứng/phôi tốt hơn. Phôi nang lợn ở trong dung dịch thủy tinh hóa 25s cho tỷ lệ sống sau thủy tinh hóa cao (Vajta và cs., 2009), nhưng sự thụ thai từ phôi sau đông lạnh-giải đông chỉ đạt được khi phôi ở trong dung dịch thủy tinh hóa 60 giây.
Khi tế bào trứng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh nồng độ cao thì ngay lập tức xảy ra một vài hiện tượng thẩm thấu. Sau đó, tế bào trứng nhanh chóng khử nước và nước nội bào được thay thế bằng chất bảo quản lạnh thấm màng. Các tế bào trứng lúc này sẽ không thể hình thành tinh thể đá ở nhiệt độ dưới 0°C. Vì vậy tế bào trứng được bảo quản lạnh mà không bị hình thành tinh thể đá trong nội bào và tránh được những tổn thương. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh với nồng độ cao có thể làm cho tế bào trứng bị ảnh hưởng bởi độc tố của các chất bảo quản lạnh. Để ngăn chặn điều này, hiện nay các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp cân bằng nhiều bước với sự có mặt của chất bảo vệ
lạnh không thấm màng. Ưu điểm nữa của thủy tinh hóa là thời gian đông lạnh nhanh, không cần các thiết bị đắt tiền, đơn giản và đặc biệt quan trọng là tỷ lệ sống của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông cao. Với các ưu điểm trên thì thủy tinh hóa đang dần trở thành một phương pháp đông lạnh thay thế có tính cạnh tranh với phương pháp đông lạnh chậm truyền thống.
Mặc dù vậy thủy tinh hóa vẫn có một số ảnh hưởng bất lợi đến tế bào trứng trong quá trình đông lạnh như: làm tăng nguy cơ của hầu hết các dạng tổn thương ngoại trừ tổn thương do sự hình thành tinh thể đá. Để giải quyết được vấn đề này trong quá trình thủy tinh hóa cần phải thiết lập hệ thống vật chứa mẫu với tốc độ đông lạnh – giải đông an toàn nhất và đáng tin cậy, tránh được sự đứt gãy màng sáng hoặc các bào quan khác, loại bỏ hoặc giảm thiểu các tác động độc hại và stress thẩm thấu của nồng độ cao các chất bảo vệ lạnh. Sự co rút tế bào gây ra bởi các chất bảo vệ lạnh không thấm màng và sự thẩm thấu không đầy đủ các chất bảo vệ lạnh có khả năng thấm màng có thể là nguyên nhân gây ra những tổn thương nội bào (Liang, 2010).