b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in
vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông
Tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông (Hình 11) được đánh giá khả năng sống và phát triển tiếp theo thông qua quá trình nuôi thành thục in vitro, khả năng tạo phôi sau khi được tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm (Bảng 12). Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ sử dụng những tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông đủ tiêu chuẩn thụ tinh (có khả năng thành thục) để đánh giá khả năng tạo phôi in vitro tiếp theo. Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh là tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro có lớp tế bào nang giãn nở, khối tế bào chất đồng đều.
Kết quả ở bảng 12 cho thấy tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh (30,94%), phân chia (18,29%) và tạo phôi dâu, phôi nang (2,44%) của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-giải đông (Hình 12, hình 13, hình 14) ở nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống vẫn thấp hơn so với hai nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và thủy tinh hóa bằng vi giọt (P<0,05). Mặc dù sự
sai khác về tỷ lệ tế bào trứng trâu phân chia giữa nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và thủy tinh hóa bằng vi giọt trong nghiên cứu của chúng tôi là không có ý nghĩa (tương ứng là 37,98% và 30,83%; P>0,05); nhưng sự sai khác về tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang giữa hai nhóm này là có ý nghĩa (tương ứng là 10,08% so với 3,31%; P<0,05).
Bảng 12: Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông Phương pháp Số tế bào trứng có hình thái bình thường sau ĐL – GĐ và tế bào trứng không đông lạnh được nuôi in vitro
Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn dùng cho thụ tinh
Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào
trứng % (M ± SE)
Số tế bào
trứng % (M ± SE)
Số phôi dâu,
phôi nang % (M ± SE)
Cọng rạ truyền thống 265 82 30,94c ± 2,68 15 18,29c ± 3,26 2 2,44c ± 4,6 Cọng rạ hở 315 129 40,95b ± 1,33 49 37,98b ± 2,52 12 10,08b ± 3,9 Vi giọt 302 120 39,73b ± 1,7 37 30,83b ± 2,06 4 3,31c ± 3,56 Đối chứng (Tế bào trứng không đông lạnh) 351 263 74,93a ± 1,54 205 77,95a ± 2,24 78 29,66a ± 1,66
Hình 12: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông bằng phương pháp cọng rạ hở sau nuôi in
vitro 24 giờ (độ phóng đại 5 lần)
Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với báo cáo của Sharma và cs. (2010). Các tác giả này cũng cho rằng khi sử dụng cọng rạ hở là vật chứa mẫu trong quá trình đông lạnh kết hợp với chất bảo vệ lạnh là Ethylene glycol cho tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông phát triển đến giai đoạn phôi nang là cao hơn so với cọng rạ truyền thống. Tương tự như vậy, khi nghiên cứu bảo quản lạnh tế bào trứng bò, Vajta và cs. (1998b) cũng nhận thấy rằng khả năng phát triển của tế bào trứng bò sau đông lạnh – giải đông có thể được cải thiện khi sử dụng cọng rạ hở so với cọng rạ truyền thống.
Trong nghiên cứu này tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia cũng như tỷ lệ tạo phôi dâu, nang của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông ở nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là cao hơn so với hai nhóm còn lại. Nguyên nhân có thể là do ở trong phương pháp cọng rạ hở lượng thể tích được giảm thiểu đáng kể (1-2μl so với 15-20μl đối với vi giọt và 150μl đối với cọng rạ truyền thống). Việc giảm thể tích dung dịch thủy tinh hóa chứa mẫu đông lạnh làm tăng tốc độ đông lạnh-giải đông; nhờ đó làm giảm đi những ảnh hưởng bất lợi cho tế bào trứng.
Hình 13: Phôi trâu 2 tế bào ở ngày thứ 2 sau thụ tinh từ tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải
đông (độ phóng đại 40 lần)
Đầu của cọng rạ hở được thiết kế với đường kính nhỏ và thành của cọng rạ hở mỏng, do đó tế bào trứng được giữ trong cọng rạ hở với lượng thể tích rất nhỏ (1-2µl), nhờ vậy tốc độ đông lạnh-giải đông nhanh hơn so với cọng rạ truyền thống (20 000oC/phút so với 2500oC/phút) (Rall và Fahy, 1985; Vajta và cs., 1998a). Tốc độ đông lạnh – giải đông nhanh giúp cho tế bào trứng vượt qua được vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 15oC đến -15oC (Martino và cs., 1996). Thêm vào đó, tế bào trứng trong dung dịch thủy tinh hóa được giải đông nhanh giúp cho chất bảo vệ lạnh được pha loãng và loại bỏ nhanh hơn. Điều này làm giảm thời gian tế bào trứng phải tiếp xúc với nhiệt độ và nồng độ chất bảo vệ lạnh không thích hợp (Sharma và Purohit, 2008).
Hình 14: Phôi nang trâu in vitro tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng
đại 40 lần)
Trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống, cọng rạ sẽ được giải đông trong nước ấm và sau đó được cắt đầu. Việc làm này khiến tế bào trứng mất nhiều thời gian hơn để vượt qua các điều kiện có ảnh hưởng bất lợi đến khả năng sống và phát triển tiếp theo của chúng sau đông lạnh - giải đông (Sharma và Purohit, 2008).
Subramaniam và cs. (1990) đã báo cáo rằng việc để cọng rạ trong không khí trước khi cho vào bể ấm là rất quan trọng trong việc ngăn chặn sự phá vỡ
màng sáng trong quá trình giải đông. Nhưng Yunus và Ayhan. (2005) lại cho rằng mặc dù cọng rạ được để trong không khí 5 giây, tế bào trứng vẫn bị đứt gãy màng sáng. Nguyên nhân có thể là do sự thủy tinh hóa trở lại trong quá trình giải đông với tốc độ đông lạnh – giải đông trong cọng rạ truyền thống 0,25ml. Chính vì thế phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống đối với tế bào trứng trâu không mang lại kết quả như mong đợi, hơn thế nữa còn làm cho tế bào trứng bị một số tổn thương lạnh.
Phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt cũng làm tăng tốc độ đông lạnh – giải đông bằng cách giảm bớt lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa chứa mẫu (15-20μl) và loại bỏ lớp cách nhiệt. Đây là phương pháp thủy tinh hóa đơn giản nhất bởi vì các giọt dung dịch thủy tinh hóa chứa tế bào trứng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng. Liang và cs. (2011) đã báo cáo về tỷ lệ sống và tạo phôi nang của tế bào trứng trâu thành thục sau đông lạnh – giải đông tương ứng là hơn 90% và 15% khi được thủy tinh hóa bằng phương pháp vi giọt. Trong nghiên cứu này mặc dù tỷ lệ thành thục in vitro trở lại và tỷ lệ phân chia của tế bào trứng trâu sau thủy tinh hóa bằng vi giọt và cọng rạ hở là không khác nhau nhưng tỷ lệ tạo phôi dâu, nang của nhóm cọng rạ hở (10,08%) là cao hơn so với vi giọt (3,31%).
Mặc dù có ưu thế hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống nhưng khả năng phân chia, tạo phôi của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-giải đông ở phương pháp vi giọt vẫn kém hơn so với phương pháp cọng rạ hở. Nguyên nhân có thể là do lượng thể tích dung dịch chứa mẫu trong phương pháp thủy tinh hóa vi giọt vẫn lớn hơn so với cọng rạ hở (15-20µl so với 1-2µl). Thêm vào đó khi giọt dung dịch VS có chứa tế bào trứng được thả thẳng vào trong nitơ lỏng sẽ hình thành xung quanh nó một lớp áo khoác hơi. Giải thích cho hiện tượng này khá đơn giản: điểm sôi của nitơ lỏng là -196oC, chính vì thế bất kỳ một vật gì ấm hơn nó và liên kết với nó sẽ gây ra hiện
tượng sôi và bốc hơi mạnh trên bề mặt của nó, do đó sẽ hình thành xung quanh vi giọt một lớp áo khoác hơi bao xung quanh nó. Dạng áo khoác hơi này không chỉ có chức năng như một lớp cách nhiệt mà còn làm chậm quá trình chìm xuống nitơ lỏng của giọt dung dịch VS này, do đó nó cũng làm giảm tốc độ đông lạnh và ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh.
Theo kết quả thể hiện ở bảng 12, mặc dù phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp cọng rạ truyền thống và vi giọt nhưng tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia, tạo phôi của nhóm cọng rạ hở vẫn thấp hơn so với đối chứng (tương ứng là 74,93%; 77,95%; 29,66%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là các tế bào trứng ở giai đoạn chưa thành thục.
Tỷ lệ thụ tinh, phát triển của phôi từ các tế bào trứng chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông thấp là do nhiều nguyên nhân. Bản thân tế bào trứng có cấu trúc phân tử phức tạp, có một số cấu trúc rất nhạy cảm vởi nhiệt độ thấp, áp suất thẩm thấu như là trục chính của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân (Fuku và cs., 1995). Các nghiên cứu trước đây cho thấy, tế bào trứng chưa thành thục khi tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh hoặc trải qua quá trình đông lạnh sẽ làm tăng số lượng tế bào trứng có thoi vô sắc, nhiễm sắc thể và sự phân bố của vi sợi không bình thường khi được nuôi thành thục in vitro sau đông lạnh – giải đông. Những bất thường về mặt tế bào học có thể ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh (Kim và cs., 2007).
Dựa trên kết quả của mục 3.5.1; 3.5.2; 3.5.3 cho thấy khi đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ hở mang lại hiệu quả tốt hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và vi giọt. Thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là một phương pháp đông lạnh đơn giản, hiệu quả trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu mà không
ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông.