b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm 2013 tại: - Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi.
- Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ
Tế bào trứng trâu trước khi đông lạnh được hiểu là tổ hợp tế bào trứng và tế bào nang trứng. Tất cả các thao tác từ lúc thu tế bào trứng cho đến lúc đông lạnh, giải đông đều liên quan đến tổ hợp này. Theo Mehmood và cs. (2011a), mặc dù phương pháp cắt lát cho tỷ lệ thu tế bào trứng cao hơn nhưng tỷ lệ tế bào trứng tốt và thành thục lại thấp hơn rất nhiều so với phương pháp chọc hút. Chính vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp chọc hút để thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ.
Một hạn chế trong việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh sản trên trâu là tỷ lệ thu tế bào trứng chưa thành thục từ các buồng trứng thấp. Trong nghiên cứu này số tế bào trứng trâu thu được trung bình là 4,9 tế bào trứng/buồng trứng; trong đó số tế bào trứng trâu có chất lượng tốt thu được trung bình là 2 tế bào trứng/buồng trứng (Bảng 2).
Số buồng trứng Số tế bào trứng thu được Số tế bào trứng thu được/buồng trứng (Mean ± SE) Số tế bào trứng loại A, B Số tế bào trứng loại A, B/buồng trứng (Mean ± SE) Số tế bào trứng loại C, D Số tế bào trứng loại C, D/buồng trứng (Mean ± SE) 565 2770 4,9 ± 0,36 1130 2 ± 0,2 1640 2,9 ± 0,33
Kết quả thu tế bào trứng trâu trên một buồng trứng trong nghiên cứu của chúng tôi là thấp hơn so với bò (4,9 tế bào trứng/buồng trứng so với 8-12 tế bào trứng/buồng trứng).
Hình 1: Tế bào trứng trâu ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (độ phóng đại 10 lần)
Kết quả thu tế bào trứng trâu có chất lượng tốt (Hình 1) từ buồng trứng lò mổ của chúng tôi đạt 2 tế bào trứng/ buồng trứng là phù hợp với Das và cs. (1996). Các tác giả này cho rằng tỷ lệ tế bào trứng trâu tốt nếu thu từ những nang có đường kính 2-8 mm trên buồng trứng trâu sẽ dao động từ 0,7 – 2,4 tế bào trứng trâu tốt/buồng trứng. Kết quả đánh giá chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ trong nghiên cứu này là cao hơn so với Totey và cs. (1992) (0,7 tế bào trứng tốt/buồng trứng); Das và cs. (1996) (0,9 tế bào trứng tốt/buồng trứng); Samad và cs. (1998) (1,76 tế bào trứng tốt/buồng trứng); nhưng thấp hơn so với Gasparrini và cs. (2000) (2,4 tế bào trứng tốt/buồng trứng).
Số lượng tế bào trứng trâu tốt thu được trên một buồng trứng là thấp khi được so sánh với gia súc khác như bò (10 000 đến 19 000 so với 150 000) (Danell, 1987). Có một số nguyên nhân để lý giải cho điều này. Nguyên nhân thứ nhất là do bản thân buồng trứng trâu có số lượng nang trứng nguyên thủy ít. Ngoài ra, tỷ lệ nang trứng nhỏ và kém chất lượng trên buồng trứng trâu cũng chiếm một tỷ lệ lớn (82 - 92%) (Palta và Chauhan, 1998), do đó tỷ lệ nang thoái hóa ở buồng trứng trâu cũng cao (70,6 - 82%). Thêm vào đó trâu được giết mổ thường là trâu đã già có dự trữ nang cạn kiệt nên tỷ lệ thu tế bào trứng trâu tốt từ buồng trứng lò mổ thấp. Sự khác nhau về kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ trong mỗi nghiên cứu liên quan đến sự khác nhau về mặt địa lý, chất lượng trâu ở lò mổ, mùa thu buồng trứng, số lượng buồng trứng, kích thước và giai đoạn của chu kỳ buồng trứng và kỹ thuật thao tác của kỹ thuật viên.
3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu vitro của tế bào trứng trâu
Hiện nay, kỹ thuật tạo phôi in vitro đã tạo ra một nguồn phôi dồi dào, có chất lượng sử dụng cho cấy truyền phôi (Nandi và cs., 2002). Quy trình tạo phôi
in vitro được thực hiện theo các bước sau: nuôi thành thục in vitro tế bào trứng, thụ tinh in vitro tế bào trứng và nuôi in vitro tế bào trứng đã phân chia sau thụ tinh đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang.
Mặc dù đã tạo ra được nghé từ cấy truyền phôi trâu in vitro nhưng hiệu quả của quá trình tạo phôi trâu in vitro vẫn thấp hơn khi được so sánh với bò (Chauhan và cs., 1997a). Quá trình nuôi thành thục tế bào trứng rất quan trọng, có ảnh hưởng tới sự thành công của quy trình tạo phôi in vitro. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành thục in vitro của tế bào trứng như: môi trường nuôi thành thục, chất lượng tế bào trứng, các chất bổ sung... (Gabr và cs., 2015). Để nâng cao hiệu quả quá trình tạo phôi trâu in vitro, các yếu tố kích thích tăng
trưởng như FSH, LH thường được bổ sung vào môi trường nuôi thành thục với mục đích tăng tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro (Saeki và cs., 1991). Theo Abdoon và cs. (2001) việc bổ sung FSH và eCG vào môi trường nuôi thành thục có thể nâng cao tỷ lệ tế bào trứng thành thục.
Hiện nay có nhiều dạng môi trường được sử dụng trong nuôi thành thục
in vitro tế bào trứng như: TCM 199, Ham’s F-10; Ham’s F-12, DMEM. Tuy nhiên những môi trường này chỉ là những môi trường cơ bản dùng cho nuôi tế bào, không có khả năng hỗ trợ cao cho sự thành thục của tế bào trứng. Chính vì thế khi sử dụng những môi trường này trong nuôi thành thục in vitro tế bào trứng thường được bổ sung thêm huyết thanh và hormone (Kumar và Anand, 2012).
Có nhiều dạng huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng như: huyết thanh trâu động dục (BOS); huyết thanh thai bò (FCS); huyết thanh trâu gây siêu bài noãn (SBS); huyết thanh bê đực (SS). Chauhan và cs., 1998a đã nghiên cứu hiệu quả của việc sử dụng FCS, SBS, BOS và SS đối với tế bào trứng trâu. Việc nghiên cứu so sánh hiệu quả giữa các loại huyết thanh này là khó do có sự sai khác giữa các nhóm thí nghiệm. Theo các tác giả này, mức độ giãn nở của tế bào nang và thành thục của nhân là không khác nhau giữa các nhóm. Tỷ lệ phân chia với FCS là thấp hơn so với BOS, SBS, SS. Trong khi đó tỷ lệ phôi phân chia phát triển đến phôi nang với SBS lại cao hơn so với BOS, FCS và SS. Tuy nhiên, đa số các phòng thí nghiệm thường sử dụng FCS là dạng huyết thanh phổ biến bổ sung vào môi trường nuôi tế bào.
Đã có một số nghiên cứu được thực hiện nhằm so sánh các dạng môi trường và các chất bổ sung vào môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu (Chauhan và cs., 1997b; Gasparrini và cs., 2006; Gabr và cs., 2015). Trong nghiên cứu này, với mục đích nâng cao hiệu quả tạo phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá
ảnh hưởng của một số dạng môi trường nuôi thành thục đến sự thành thục và hiệu quả tạo phôi trâu in vitro.
Môi trường được sử dụng rộng rãi hiện nay trong nuôi thành thục in vitro
tế bào trứng trâu là TCM 199 và Ham’s F-10 (Kumar và Anand, 2012; Hammam và cs., 2010). Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu là TCM 199 hoặc Ham’s F-10 có bổ sung thêm kháng sinh (100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml), huyết thanh thai bò (FCS), hormone kích thích nang trứng (FSH). Hiệu quả của các dạng môi trường nuôi được đánh giá dựa vào tỷ lệ thành thục và tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau nuôi. Sử dụng phương pháp nhuộm nhân tế bào như đã mô tả ở mục 2.4.4 để đánh giá sự thành thục của tế bào trứng. Tế bào trứng thành thục là tế bào trứng có nhân ở giai đoạn Metaphase II, xuất hiện thể cực thứ nhất.
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu trâu
Kết quả thể hiện ở bảng 3 cho thấy không có sự khác nhau (P>0,05) khi so sánh tỷ lệ thành thục giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi bổ sung riêng lẻ FCS và FSH. Kết quả này tương tự như báo cáo của Hegab và cs. (2009). Hegab và cs. (2009) cũng không nhận thấy sự khác nhau giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi cùng bổ sung FCS.
Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199 thì môi trường Ham’s F-10 cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với TCM 199 (tương ứng là 74,64% và 63,28%; P<0,05). Thậm chí theo kết quả ở bảng 3, khi nuôi tế bào trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi cao nhất (74,64%; P<0,05).
Bảng 3: Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi khác nhau
Môi trường nuôi thành thục
Số tế bào trứng nuôi thành thục Tế bào trứng thành thục Số tế bào trứng % (M ± SE) TCM 199 + FCS 203 102 50,24c ± 1,38 TCM 199 + FSH 200 103 51,5c ± 1,47 TCM 199 + FCS + FSH 207 131 63,28b ± 1,72 Ham F10 + FCS 213 108 50,7c ± 1,39 Ham,s F10 + FSH 209 112 53,6c ± 1,28 Ham,s F10 + FCS + FSH 209 156 74,64a ± 1,76
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả này cho thấy FSH có tác động tích cực đến sự thành thục in vitro
mẽ của lớp tế bào nang bao xung quanh, bởi vì các tế bào nang chính là cầu nối trao đổi giữa tế bào trứng và môi trường nuôi trong quá trình nuôi thành thục in vitro. Sự có mặt của FSH trong môi trường nuôi thành thục sẽ làm tăng quá trình giãn nở của lớp tế bào nang, kích thích quá trình thành thục nhân của tế bào trứng (Totey và cs., 1992, 1993; Palta và Chauhan, 1998), qua đó sẽ làm tăng tỷ lệ tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro.
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy Ham’s F-10 nâng cao được hiệu quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu hơn TCM 199. Điều này là phù hợp với báo cáo của Hammam và cs. (1997); Totey và cs. (1992); Abdoon và cs. (2001). Abdoon và cs. (2001) nhận thấy tế bào trứng trâu được nuôi thành thục in vitro
trong Ham’s F-10, sau thụ tinh có tỷ lệ phân chia và phát triển tốt hơn khi nuôi thành thục in vitro trong TCM 199; MEM hoặc RPMI-1640. Hammam và cs. (1997) cũng nhận thấy rằng Ham’s F-10 là môi trường nuôi thành thục tế bào trứng trâu có hiệu quả hơn so với TCM 199. Kết quả này cũng được Totey và cs. (1992) khẳng định; các tác giả này cho rằng khi nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung FCS và hormone cho hiệu quả cao hơn nuôi trong môi trường TCM 199 có bổ sung FCS và hormone.
3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu vitro của tế bào trứng trâu
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc bổ sung riêng lẻ FSH vào môi trường TCM 199 và Ham’s F-10 cho tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FCS vào hai môi trường này (Bảng 4).
Bảng 4: Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau
Môi trường nuôi thành thục Số tế bào trứng thụ tinh Tế bào trứng phân chia
Phôi dâu, phôi nang
Số tế bào trứng % (M ± SE) Số phôi dâu, phôi nang % (M ± SE) TCM 199 + FCS 123 51 41,46c ± 1,36 10 8,13c ± 1,55 TCM 199 + FSH 129 67 51,94c ± 1,47 11 8,53c ± 1,75 TCM 199 + FCS + FSH 160 104 65b ± 0,9 30 18,75b ± 0,93 Ham’s F10 + FCS 127 65 51,18c ± 1,34 11 8,66c ± 1,19 Ham’s F10 + FSH 138 94 68,12b ± 1,12 25 18,12b ± 1,41 Ham’s F10 + FCS + FSH 184 144 78,26a ± 1,79 54 29,35a ± 1,25
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả trên là phù hợp với báo cáo của Totey và cs. (1992; 1993); Palta và Chauhan (1998). Các tác giả này đã chỉ ra rằng FSH là yếu tố cần thiết cho sự giãn nở của tế bào nang và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu bởi vì
FSH có ảnh hưởng đến sự giãn nở của tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng, do đó nó có ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh, tạo phôi in vitro.
Ali và Sirard (2002) cũng khẳng định rằng việc bổ sung FSH và E2 trong suốt quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào sẽ làm tăng số lượng phôi dâu, phôi nang in vitro.
Hiệu quả của việc tạo phôi trâu in vitro được nâng cao khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199. Tỷ lệ phân chia (tương ứng 78,26% và 65%); tạo phôi dâu, phôi nang (tương ứng 29,35%và 18,75%) trong môi trường nuôi có bổ sung kết hợp FSH và FCS cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FSH, FCS (P<0,05; Bảng 4). Kết quả này là phù hợp với báo cáo của Chauhan và cs. (1997b); Chohan và Hunter (2003); Totey và cs. (1992). Các tác giả này cũng nhận thấy việc bổ sung riêng lẻ hormone hoặc huyết thanh vào môi trường TCM 199 sẽ không cải thiện được tỷ lệ thụ tinh (phân chia) in vitro.
Neglia và cs. (2001) cũng cho rằng việc sử dụng kết hợp FCS, LH và estradiol trong môi trường nuôi thành thục sẽ làm tăng tỷ lệ tế bào trứng trâu và bò thành thục in vitro. Trong môi trường Ham’s F-10 khi bổ sung luteinizing hormone (LH) sẽ cải thiện đáng kể tỷ lệ thành thục, còn việc thêm follicle stimulating hormone (FSH) và estradiol làm tăng tỷ lệ tạo phôi nang. Ngược lại trong TCM-199, LH không nâng cao tỷ lệ thành thục nhưng việc bổ sung FSH và oestradiol lại làm tăng tỷ lệ này.
Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu được thành thục trong môi trường Ham’s F-10 + FCS + FSH là cao hơn so với các môi trường còn lại (tương ứng là 78,26%; 29,35%; P<0,05). Kết quả của chúng tôi cho thấy việc sử dụng môi trường Ham’s F-10 trong quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu mang lại hiệu quả tạo phôi trâu in vitro cao hơn so với môi trường TCM 199 ở cùng điều kiện. Kết quả
này là phù hợp với báo cáo của Abdoon và cs. (2001). Theo Abdoon và cs. (2001) tế bào trứng thành thục trong Ham’s F-10 sau thụ tinh có tỷ lệ phân chia và phát triển tốt hơn thành thục trong TCM - 199; MEM hoặc RPMI-1640.
Kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 đã chỉ ra rằng tế bào trứng trâu được nuôi thành thục in vitro trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ thành thục, phân chia và tạo phôi hiệu quả hơn các môi trường còn lại. Với kết quả đó chúng tôi sử dụng môi trường nuôi thành thục in vitro Ham’s F- 10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho các thí nghiệm nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu trong luận án này.
3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau vitro khác nhau
Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện ở bảng 5. Nguồn gốc chủ yếu của tế bào trứng sử dụng cho thủy tinh hóa là từ buồng trứng lò mổ. Kết quả nghiên cứu của luận án này cho thấy khi nhuộm nhân các tế bào trứng trâu loại A, B ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (tương ứng với thời gian nuôi in vitro 0 giờ) để kiểm tra, tất cả các tế bào trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV) (100%). Điều này là phù hợp với nhận định của Parnpai và cs. (2014), theo họ tế bào trứng được thu từ những nang trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm