b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)
2.4. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu số lượng và chất lượng trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 1)
Thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ bằng phương pháp chọc hút. Đánh giá số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu ngay sau khi thu. Phân loại chất lượng tế bào trứng dựa vào quan sát hình thái.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 2)
Tế bào trứng trâu sau phân loại được nuôi thành thục in vitro trong 6 môi trường: TCM 199 + 10% FCS + kháng sinh, TCM 199 + 5μg/ml FSH+ kháng sinh, TCM 199 + 10% FCS + 5μg/ml FSH+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 10% FCS+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 5μg/ml FSH+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 10% FCS + 5μg/ml FSH+ kháng sinh. Sau nuôi thành thục, các tế bào trứng được thụ tinh in vitro và tạo phôi in vitro.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 3 và 6)
Xác định giai đoạn phát triển chủ yếu của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) bằng phương pháp nhuộm nhân, kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh (riêng lẻ hoặc kết hợp) ở nồng độ 6M. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trong môi trường đã lựa chọn ở thí nghiệm 2.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 4, lựa chọn dạng chất bảo vệ lạnh thích hợp sử dụng cho thí nghiệm 5. Tế bào trứng trâu được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh đã lựa chọn ở thí nghiệm 4 với các nồng độ 2M, 4M, 6M và 8M. Dung dịch giải đông là TCM 199. Tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trong môi trường đã lựa chọn ở thí nghiệm 2.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 5, dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 6. Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 bằng ½ bước 1. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 trong thí nghiệm này là 30 giây, 1 phút, 2 phút, 3 phút.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)
Từ kết quả của thí nghiệm 6, dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 7. Đông lạnh trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Dung
dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã được lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông gồm hai dạng: dạng I là TCM 199; dạng II là hai dung dịch V1 (TCM 199 + 0,5M sucrose) và V2 (TCM 199 + 0,25M sucrose). Đối với dung dịch giải đông dạng I, trứng sau giải đông được để 5 phút trong dung dịch giải đông. Còn đối với dạng II: trứng sau giải đông được chuyển lần lượt vào dung dịch V1 và V2 mỗi lần 5 phút.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 5)
Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng 3 phương pháp: thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở, thủy tinh hóa vi giọt. Sử dụng dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian và cách thức tiếp xúc và dung dịch giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6 và 7. Tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trở lại, thụ tinh và tạo phôi in vitro.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 6)
Các tế bào trứng trâu sẽ được đông lạnh ở các thời điểm nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ). Sử dụng phương pháp đông lạnh với dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian và cách thức tiếp xúc và dung dịch giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6, 7 và 8.
Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm được thể hiện ở phần phụ lục