4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1.5.5.1.Đông lạnh chậm (Slow-freezing)
Đây là phương pháp áp dụng thành công đầu tiên cho việc bảo quản lạnh tế bào trứng/phôi của động vật có vú. Cơ chế của đông lạnh chậm là tạo tinh thể đá ngoại bào và ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào. Các chất bảo vệ lạnh thấm màng có thể đi vào bên trong tế bào trứng và khử nước của tế bào trứng (Liang, 2010). Nguyên tắc của phương pháp này là tạo ra sự kết tinh nước trong nội bào một cách chậm và có kiểm soát. Nước được đi ra hay đi vào tế bào nhờ vào độ nhớt hoặc sự hóa rắn mà không có sự hình thành tinh thể đá nội bào. Đông lạnh chậm kiểm soát tốc độ đông lạnh ở mức 0,3 -0,5oC/phút, vì vậy nước nội bào có thể đủ thời gian đi ra khỏi tế bào trứng. Đông lạnh chậm là đòi hỏi tốc độ đông lạnh chậm và dài trước khi mẫu được chuyển vào nitơ lỏng. Đó là phương pháp cân bằng truyền thống khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh thấm màng. Phương pháp này gồm có việc sử dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ thấp (1-2M) với quá trình khử nước diễn ra từ từ để đáp ứng dần với nồng độ của các phần đông lạnh ngoại bào trong suốt quá trình hình thành tinh thể đá nội bào đồng thời duy trì sự cân bằng giữa các nhân tố làm ảnh hưởng đến sự tổn thương tế bào.
Phương pháp đông lạnh chậm gồm các bước sau:
- Tế bào trứng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp ở nhiệt độ phòng tới khi đạt được sự cân bằng giữa dung dịch chất bảo vệ lạnh và tế bào trứng. Tế bào trứng sau đó được nạp vào cọng rạ.
- Cọng rạ được cho vào máy đông lạnh và được làm lạnh ở nhiệt độ -5 đến -7oC, tại đây chúng được giữ vài phút để cân bằng. Sau khi cân bằng dung dịch sẽ được tạo mầm đá để bắt đầu quá trình đông lạnh nội bào với tốc độ đông lạnh khoảng 0,3-0,5oC/phút, để đảm bảo nhiệt độ đồng đều trong mẫu cho tới khi đạt đến -65oC. Lúc này nồng độ chất bảo vệ lạnh trong nội bào đủ cho nước nội bào hóa rắn mà không hình thành tinh thể đá nội bào. Khi đó cọng rạ chứa mẫu được nhúng ngập vào trong nitơ lỏng để bảo quản cho tới khi sử dụng.
Trong phương pháp đông lạnh chậm, tinh thể nước đá được tạo ra ở nhiệt độ 6oC bằng cách tạo mầm đá, sự hình thành tinh thể đá nhỏ này sẽ cho phép hình thành tiếp các tinh thể đá khác. Mầm đá thường được thực hiện bằng cách dùng một dụng cụ rất lạnh (chẳng hạn như cái kẹp) chạm vào bên ngoài của vật chứa mẫu để tạo ra một tinh thể đá nhỏ hình thành bên ngoài vùng chứa mẫu bảo quản lạnh. Kết quả của sự hình thành đá là giải phóng ra năng lượng thường được gọi là phản ứng tổng hợp nhiệt. Do đó, dung dịch thường được giữ ở nhiệt độ này trong một thời gian, khoảng 10-30 phút để cân bằng. Sự phát triển các tinh thể đá sẽ làm tách các chất hòa tan khỏi nước, do đó dần tăng nồng độ của chúng trong dung dịch còn lại. Chính vì thế, mầm đá phải được thực hiện ở vị trí xa tế bào trứng để các tinh thể đá phát triển dần dần về phía tế bào trứng. Sau khi cân bằng, nhiệt độ giảm xuống -32oC. Trong suốt thời gian này, các tinh thể đá dần dần lan truyền trong môi trường ngoại bào, nồng độ chất bảo vệ lạnh tiếp tục tăng, đặc biệt là ở không gian nội bào, trong khi đó sự khử nước vẫn diễn ra nhờ vào các chất bảo vệ lạnh không thấm màng. Tốc độ đông lạnh chậm (0,33oC/
phút) giúp tế bào trứng bổ sung từ từ các chất bảo vệ lạnh thấm màng trong khi vẫn duy trì sự cân bằng với không gian ngoại bào. Tốc độ trao đổi chất của tế bào trứng tại thời điểm này là chậm.
Trong quá trình giải đông, sự thay đổi nhanh chóng của nhiệt độ phù hợp để ngăn chặn sự hình thành lại tinh thể đá của nước và những tổn thương do tinh thể đá gây ra. Đây là bước cần phải thực hiện để tránh shock thẩm thấu từ các chất bảo vệ lạnh thấm màng, mà tại đó nồng độ của chúng trong nội bào là rất cao. Vì vậy, việc thêm chất bảo vệ lạnh không thấm màng đã được sử dụng. Khi các chất bảo vệ lạnh thấm màng khuếch tán ra khỏi tế bào trứng, nồng độ các chất bảo vệ lạnh không thấm màng dần dần được giảm xuống, cho đến khi tế bào trứng được chuyển vào môi trường dùng cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
Đối với phương pháp đông lạnh chậm thì tốc độ đông lạnh được kiểm soát, nó cho phép sự trao đổi giữa dung dịch nội bào và ngoại bào mà không có ảnh hưởng thẩm thấu nghiêm trọng và làm biến dạng tế bào. Trong suốt quá trình kiểm soát tốc độ đông lạnh, nước bị thay đổi giữa dung dịch nội và ngoại bào mà không chịu ảnh hưởng của tính thấm màng. Trong quá trình này, việc tạo đá nội bào và tốc độ đông lạnh chậm sẽ đảm bảo rằng đông lạnh chỉ xảy ra ở bên ngoài tế bào, kết quả là nhờ áp suất thẩm thấu nước chuyển từ trong ra ngoài tế bào và sự khử nước xảy ra từ từ cho đến khi chúng đạt đến nhiệt độ mà tại đó nội bào được đông lạnh (Mazur, 1963). Do đó đông lạnh chậm làm giảm các yếu tố gây tổn thương đến tế bào như: sự hình thành tinh thể đá, rạn nứt và tổn thương do độc tố và áp suất thẩm thấu.
Mặc dù nồng độ chất bảo vệ lạnh có thể gây độc cao ở các giai đoạn cuối cùng của quá trình đông lạnh, nhưng do nó diễn ra ở nhiệt độ thấp nên đã hạn chế ảnh hưởng của độc tố đến mức thấp nhất. Chính vì vậy sự đông đặc tinh thể
đá nội bào giảm xuống tới một mức độ chấp nhận được hoặc được loại bỏ hoàn toàn. Đông lạnh chậm đem lại một kết quả chấp nhận được đối với tế bào trứng của một số loài mà không bị ảnh hưởng mạnh bởi tổn thương lạnh, thí dụ như là mèo, người, chuột. Tuy nhiên tế bào trứng trâu, bò và lợn chịu ảnh hưởng tổn thương lạnh mạnh hơn và kết quả bảo quản kém hơn khi được đông lạnh bằng phương pháp đông lạnh chậm. Quy trình đông lạnh chậm có thể có hại cho những tế bào trứng có độ nhạy cảm cao với những tổn thương lạnh vì các tế bào trứng sẽ phải tiếp xúc lâu ở nhiệt độ dễ gây tổn thương cho chúng (Liang, 2010). Có thể giảm thiểu được vấn đề này bằng cách sử dụng nhiệt độ cân bằng cao kết hợp với tốc độ đông lạnh nhanh để nâng cao hiệu quả bảo quản lạnh những tế bào trứng có độ nhạy cảm cao với những tổn thương lạnh (Martino và cs., 1996; Isachenko, 1997; Le Gal và Massip, 1999; Vajta và cs., 1998b).