- Hấp phụ ở nhiệt độ 36,5°C±0,5°C trong 1 giờ
b. Phản ứng trung hòa vi lượng
Dụng cụ và trang thiết bị
- Tủ ấm CO2 (Sanyo) - Pipet Aid (Thermo)
- Kính hiển vi đảo pha (Olympus) - Pipetman (Gilson)
- Máy trộn (Stuard) - Đầu típ 200µl, 1000µl (Corning)
- Phiến nuôi tế bào 96 giếng (Nunc)
- Pipet 10ml, 25ml (Corning)
- Máy ủ nhiệt (Memmert) - Tuýp nhựa 1,5ml (Eppendorf)
Vật liệu và hóa chất
- Tế bào vero - Trypsin (Gibco)
- Huyết thanh mẫu thử - Chủng virut EV71 thử thách (Vabiotech)
- Môi trường MEM (Gibco) - FBS (Gibco)
Tiến hành
- Huyết thanh pha loãng 1/4 và được bất hoạt ở nhiệt độ 56°C trong 30 phút. - Huyết thanh sau bất hoạt pha loãng bậc 2 trên phiến nuôi cấy 96 giếng (Cột 1 đến cột 11 từ hàng A đến hàng H).
- Cho môi trường MEM 2% FBS vào các giếng CC (Giếng E12 đến H12) - Cho virut thử thách có hiệu giá 100 TCID50 vào các giếng trừ giếng CC - Ủ phiến trong tủ ấm CO2 36,5°C ± 0,5°C trong 3 giờ.
- Cho hỗn dịch tế bào chứa 1 x 105 tế bào/ml vào tất cả các giếng. - Ủ phiến trong tủ ấm CO2 36,5°C ± 0,5°C trong 7 ngày
Hình 2.1. Sơ đồ phiển phản ứng trung hòa vi lượng
Bậc pha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A: 1/8 CC B:1/16 CC C:1/32 CC D:1/64 CC E:1/128 CKN F:1/256 CKN G:1/512 CKN H CHT CHT CHT CHT CHT CHT CHT CHT CHT CHT CHT CKN
CC: Tế bào chứng; CKN: Chứng virut; CHT: Chứng huyết thanh.
Đọc kết quả:
- Soi phiến dưới kính hiển vi đảo pha để xác định vị trí các giếng bị hủy hoại - Hàng tế bào chứng : tế bào bình thường
- Hàng chứng huyết thanh: tế bào bình thường - Hàng chứng virut : tế bào hủy hoại hoàn toàn
- Hiệu giá kháng thể là nồng độ huyết thanh pha loãng cao nhất vẫn bảo vệ được 50% tế bào sống.
- Mẫu được ghi nhận là có kháng thể khi hiệu giá kháng thể ≥ 8
Tiêu chuẩn chấp thuận: